7第七章抗体工程制药.ppt

第7章抗体工程制药，I .概述，抗体(工程)制药-生物技术制药领域的重要组成部分抗原(antigen，ag)-刺激和/或诱导身体免疫系统的免疫反应，产生抗体或致敏(效果)淋巴细胞，同时在免疫反应产物和身体外特别静例如，在病原体微生物、免疫血清、药物和疫苗方面，抗原是一个国家所知道或潜在、外部或内部的“敌人”。4，免疫原性：刺激身体生成抗体和/或致敏淋巴细胞的性能。反应性：相应的抗体和/或淋巴细胞特异性结合，发生反应的特性。5，完全抗原：同时具有免疫原性和反应性的抗原。也称为微生物，异种血清抗原，不完全抗原。它本身是指只有反应源，没有免疫原性的简单小分子的抗原物质。某些药物(青霉素、等)、多糖、脂质等。6、目前在中药材中，小檗碱、茶碱、丹参酮等广泛存在的反抗源，将体内蛋白质与完全抗原结合，引起轻微过敏反应的生化活性基因的化学成分都有可能成为反抗源。7，抗原的特异性同时出现在免疫原性和反应性上。沙门氏菌，大肠杆菌，免疫球蛋白的结构，抗体：具有免疫功能的球蛋白，与相应抗原特异性结合。抗体生成过程：身体的免疫系统受到抗原物质刺激后，b淋巴细胞激活并增殖，分化为血浆细胞，由血浆细胞合成并分泌的球蛋白。免疫球蛋白(Ig)分子量范围为150，000到950，000道尔顿。第5类：IgG在血清中含量最高，达到75%到80%，是抗感染主要抗体。IgM是5种免疫球蛋白中分子量最大的，5种凝集物质，是反应一种抗原时产生的第一种抗体。虱子参与粘膜表面、乳房、泪腺形成，主要是局部免疫反应；IgD的血清含量很低。IgE的血清含量最低。免疫球蛋白、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、动物血清中抗体生成的时间表、抗原刺激的前三周、IgM生成；抗原再次刺激后，IgG将取代IgM，抗体研究开发阶段：白喉抗毒素在1890年被Behring发现，作为抗原免疫动物获得多克隆抗体。 1975年米尔斯坦2。免疫动物-老鼠(Balb/C，老鼠年龄6-8周)或老鼠(Lou)；3 .常用骨髓瘤细胞株-SP2/0，P3.653细胞是磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏的菌株，不是hypopine细胞。免疫方法：体外免疫方法；体内免疫法，体内免疫法-颗粒性抗原(如细菌、细胞)的免疫原性，不含佐剂，可用性抗力将小鼠10-100ug抗原和proson完全佐剂混合在同一量后腹腔内。弗完全助剂(Freund scompleted juvant，FCA) :是由矿物油(如降脂烷烃或液体石蜡等)、乳化剂和活的霉菌组成的乳化剂。瓣不完全佐剂mycobacterium，免疫佐剂(adjuvant)(1)定义：先于抗原或与抗原混合注入身体，能提高抗原的免疫原性的物质。(2) 弱免疫原性物质的应用；免疫原容量不足。(3)助剂类型1)油性乳液-引物助剂(Freundadjuvant)2)无机化合物3)微生物及其产物4)脂质体5)细胞因子，Ii。细胞融合和异种杂交细胞的选择性培养1。细胞融合的基本方法(PEG融合)脾细胞骨髓瘤细胞(“永久”细胞)(1108)(23107)聚乙二醇(PEG) 37-40 2 mins融合细胞(杂交瘤细胞)细胞可以添加二甲基亚砜(DMSO)。2002年12月，神舟4号宇宙飞船发射了b淋巴细胞和骨髓瘤细胞，进行了细胞融合实验。原理：细胞融合时，培养液中只有部分细胞融合为杂交细胞，有很多未融合的双亲细胞。这需要杂交细胞的分离纯化。为此，要创造只生长和繁殖杂交细胞，使亲本细胞死亡的环境。应利用异种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。2，杂交瘤细胞选择性培养液一般为HAT培养基。侨民(h)、甲氨蝶呤(a可以阻断DNA合成)、胸腺嘧啶(t)。脾细胞中有磷酸核糖转移酶(HGPRT)，而不是hypopine球，因此脾-肿瘤融合异种细胞可以利用HGPRT酶用hypopine (h)和thymine (t)合成DNA，从而生长异种杂交细胞。HAT选择培养机制，主要途径糖氨基酸甲氨蝶呤(a) GMP核苷酸DNAHGPRT核苷酸祖TK (thymin kind) thymosin (t) dtmp，常用的饲养细胞包括小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞等。89天内，在所有克隆活体培养中检测抗体，筛选出产生抗体的阳性克隆人，培养板，b细胞杂交的技术过程，3 .选择良性克隆和克隆1。筛选方法：免疫酶技术放射免疫荧光技术，(1)免疫酶技术，原理：抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后，改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，或不影响酶本身的酶活性，在相应作用基质的参与下涂上基质水解液，或将氢供体从无色原型变成着色氧化型，表示某种抗原或抗体的存在。(2)免疫荧光法，原理：抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微追踪的准确性相结合。用路西法作为标记，与已知抗体(或抗原)结合，然后用标记路西法的抗体或抗原作为标准试剂，检测和鉴定抗原或抗体。免疫荧光法用于检测细胞抗原的抗体检测，尤其是患者活检组织标本。(3)放射免疫技术，原理：同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，将放射性同位素用作示踪分子的标记免疫测定法。放射免疫测定药物图，2。克隆以单个细胞无性生殖，获得细胞组的整个培养过程，以提高选择性阳性复制的稳定性。限制性稀释法：每个细胞培养孔平均只包含一个细胞，分离细胞软汉琼脂法：在半固态营养琼脂糖中分散异种杂交细胞悬浮体，以实现克隆化的目的，使单细胞位置生长和繁殖成为可能。4.杂交瘤细胞及抗体特性的鉴定1。杂交瘤细胞通过染色体分析，大部分是末端着丝粒染色体，染色体数接近于两个父母染色体的总和。2.抗体识别Ig和子类识别：免疫扩散或ELISA方法亲和力识别，抗体类识别(Ig和子类识别)抗体分子可以根据大小、电容、溶解度和与抗原的作用分为不同的种类和子类别。IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)IgA(IgA1、IgA2)IgM(无)IgD(无)IgE(无)，1)免疫扩散可溶单向免疫扩散双向免疫扩散，(2)酶联免疫吸附分析法(ELISA)，原理：将抗体或抗原移植到一种固相载体表面后，根据不同阶段对检测对象样品和酶标记抗原或抗体进行吸附到固相载体表面的抗体或抗原的反应，用分离抗原抗体复合体和玻璃未结合成分的清洗方法分离，最后添加酶反应基质，并添加酶反应基质。ELISA、ELISA、v .单克隆抗体工业生产单克隆抗体生产包括细胞培养、纯化和准备过程。1.杂交瘤细胞的大规模培养生物反应器：空气提升发酵罐、中空纤维培养基、微胶囊发酵罐培养基：牛淋巴液、血清、2。大量制造单克隆抗体的方法体外培养法(收获10-400ug/ml抗体)酶板培养微载体悬浮培养(固体颗粒用deae-sephadox a 50等材料)。动物体内诱导方法-用0.5毫升姜脂/液体石蜡注入腹腔，注射1106异种细胞.收获52Omg/ml抗体。支原体污染！3 .单克隆抗体(McAb)的纯化，单克隆抗体工艺(老鼠)，单抗纯化方法：超滤盐析法离子交换法凝胶过滤法HPLC法等，3。单克隆抗体药物的现状，超过250种抗体药物在临床试验中，-1/3进入了第三期临床试验，-1/4通过了临床试验。在美国市场，13个用于治疗的抗体药物抗体药物的销售额从97-99年的4.68亿美元增加到13亿美元-03年抗体药物的总销售额达到50亿美元，抗体药物市场销售额，2011年，全球200多家上市公司或未上市公司进行临床诊断和治疗的单克隆抗体进行临床试验的抗体公司(38家)如果从异种杂交瘤细胞株构建单链抗体，则可以用PCR方法扩增可变区域基因，将其组装到适当的表达载体上。单链抗体最常用的表达系统是大肠杆菌， 1有两种表达为包含非包涵体的不溶性蛋白质的方法。高产量达到细菌蛋白质总量的5%-20%，但要进行变性复性，形成正确的立体结构，恢复抗体活性。第二种是将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端连接起来的分泌型表达，单链抗体分子分泌为质量铸钢和细菌，折叠成活性分子。但是比电子生产得少，在一般的实验室培养条件下，每升细菌产量只有数毫克左右。VH大约是整个分子的1/12。由一个域组成，称为单域抗体。单域抗体虽然亲和力有所下降，但仍然保持着面料一星的特异性。(3)单域抗体，VH，约为整个分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR组成，保持抗体的特异性。(4)最小识别单位，CDR，4双特异性抗体和多价抗体，双链抗体(Diabody)一词早在1993年就像Hollinger提出的一样。小分子的二价双特异性抗体片段。双特异性抗体(bsab)是同时识别两种抗原的抗体。一个对应于肿瘤相关抗原。另一种是对应效果成分。与目标肿瘤细胞结合，将高细胞毒性的效果细胞浓缩在肿瘤周围，模拟天然配体的作用，在细胞表面诱发分子，激活效果细胞，使肿瘤细胞的杀伤和分解成为可能。抗体的一部分被抗体序列取代而形成的融合蛋白具有称为抗体融合蛋白的新特性。抗体融合蛋白主要是fc融合蛋白(Fcfp)抗原结合融合蛋白(antigen-bindingfusionprotein，abfp)、抗体融合蛋白、Fc融合蛋白由抗体的Fc段和具有特定功能的特定蛋白质域的融合组成。CD4免疫粘附是抗体的Fc段和两个CD4分子的Ig同源区域的重建。抗原结合融合蛋白由具有抗原结合功能的抗体结构和其他功能性蛋白质融合构成。免疫毒素等抗体部分主要包括嵌合抗体，单链抗体形式。抗体融合蛋白、I、免疫粘附蛋白通过将人类抗体常数区域(主要是Fc段)N-端连接到人类细胞表面的受体分子或细胞粘附分子，在真核细胞中表达适当折叠的融合抗体蛋白分子，该分子同时发挥抗体的效果功能和其他被称为免疫粘附或新功效抗体的适当效果功能。第二，免疫毒素免疫毒素，也称为生物导弹，是通过将诱导性载体分子和具有毒性的弹头蛋白交联而成的，是诱导剂的一种。第三，催化抗体天然抗体表达结合活性，酶发挥催化活性。如何将两者的特性集中在一起，使抗体也成为催化活性物质，并使酶和相关抗原结合。催化抗体(catalyticantibody)主要构成催化抗体，该抗体将催化组与抗体分子重组。噬菌体抗体，噬菌体抗体库技术定义：通过PCR复制整个人类抗体重链和轻链v区基因，并在噬菌体表面获得特定抗体。噬菌体表面展示库技术要点：外源基因表达多肽以融合蛋白的形式出现在外壳蛋白n端，将基因组合库插入噬菌体编码膜蛋白基因G3或G8的试点系列正下方的下游，将免疫或未免疫的b细胞中的抗体全部基因片段随机复制到PCR中，通过固定化抗原“亲和联合扩增”多个周期，直接、简单、高效地筛选特异性强的抗体噬菌体库翻译的抗体分泌为细菌的主核，制作和纯化自由抗体片段，就能得到目的抗体。选定噬菌体去除基因G3或G8，然后转移到大肠杆菌。这项技术的优点：将抗体的基因型和表达型紧密联系在一起。可以绕过杂交技术，不需要复杂的基因工程技术。抗体基因筛选的广泛范围；技术稳定可靠，生产周期短。广泛应用于大规模可生产抗体的制造以及激素、酶、药物、随机多肽等其他蛋白质的生产。不经细胞融合和动物免疫等阶段，噬菌体抗体库的分类(1)根据抗体基因的性质，进行1。DNA文库2.cDNA文库(2)根据抗体基因的来源1 .天然抗体库(nativeantoiodylibrary) 2。免疫抗体库3