LAMP技术PPT课件

.,1,LAMP技术,.,2,1LAMP引物的设计LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3端的F3c、F2c和Flc区以及5端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3端的F2c区域互补F1C区与靶基因5端的Flc区域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5端的Blc区域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。,.,3,2扩增原理6065是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3末端的Fl区段为起点以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。,.,4,3LAMP的特点LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RTLAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性避免了温度循环而造成的时间损失核酸扩增在lh内均可完成，添加环状引物后时间可以节省12，多数情况在20。30rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5mgmL应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。,.,5,缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300bp以内。500bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。,.,6,4引物设计实例LAMP引物设计的在线网站(http:/primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程：首先，单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于22kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）,FASTA格式和GenBank格式文件。第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自动判断,起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等因素可以通过PimerExplore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计LAMP反应的引物。,.,7,在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑：1.引物之间的距离F2区段的5端到B2区段的5端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120180bp。F3区段的3端到F2区段的5端之间的距离是020bp(同理B2和B3之间的距离是020bp)。F2区段的5端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是4060bp。2.引物的Trn值引物的Tm值采用近邻分析法(thenearest-neighbormethod)来计算，这种方法是目前认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(saltconcentration),寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。,.,8,例如：寡核苷酸的浓度为0.1mol，钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4mM等。Tm(退火温度=h*1000/S+Rln(C/4)-273.15+16.6logNa+式中，Tm为退火温度，；为摩尔气体常数，1.987ca1/rnol；H为焓变；s为熵变；C为寡聚核苷酸的浓度；Na+为钠离子浓度。对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为6065，而对于AT富集的引物Tm值为5560。在设计引物的时候，F1c和B1c的Tm值大概是65(6466),F2,B2,B31的Tm值大概是60(5961)。3.引物末端的稳定性引物的末端作为DNA合成的起点必须有一定的稳定性，自由能改变值(G)是指反应物的自由能与产物的自由能之差，反应朝着自由能减小的方向运行口引物和目的基因之间的退火反应是一个动态平衡的反应，自由能改变值(G)越小，引物与模板之间的退火反应越容易发生。一般在进行引物设计的时候，F2/B2F3/B3的3端和F1c/B1c的5端的自由能改变值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5端扩增以后相当于F1的3端，所以它的稳定性很重要。4GC含量引物在设计的时候使其GC含量介于40%65%之间，但是当引物的GC含量介于50%60%时，引物的质量相对好一些。5.二级结构引物在设计的时候要防止形成二级结构，这一点是十分重要的，特别是内引物。,.,9,第二代DNA测序技术,.,10,Sanger双脱氧链终止法,Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。,.,11,利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，双链DNA模板，带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5-引物端和以ddC残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下