Sanger双脱氧链终止法ppt课件_第1页
Sanger双脱氧链终止法ppt课件_第2页
Sanger双脱氧链终止法ppt课件_第3页
Sanger双脱氧链终止法ppt课件_第4页
Sanger双脱氧链终止法ppt课件_第5页
已阅读5页，还剩7页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

.,DNA测序的基本方法,Sanger双脱氧链终止法,.,基本原理：,核苷酸的连接方式：磷酸二酯键,将2，3双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。,.,通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，纯单链DNA模板，带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP），ddNTP。,.,.,单链DNA可以由双链DNA完全变性而得到。其方法，简单的来说，将反应体系加热至95即可得到。,所需模板及其获得方法：,.,dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用dNTP来合成DNA。ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖2号3号C上羟基的O被脱去，由于它掺入DNA后DNA的合成就终止了，所以ddNTP是用来测序的。,dATP与ddATP的区别：,.,DNA聚合酶的特点：,其耐热性极强,在9540min,仍具有很强的聚合活性;利用重组酶在常规PCR条件下,成功扩增了5.3kb的拟南芥Timeless基因片段.,.,可以购买通用引物或实验室合成15bp26bp长度的引物，通常以2g/ml的浓度贮存于-20备用。,关于引物：,.,Sanger双脱氧链终止法的具体操作：,测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行聚合反应.在第一个反应物中,ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链,由于其3位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了;同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.,.,假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:,在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.,将得到如下结果：,产生的都是以A结尾的片段:GA,GATCCGA。,产生的都是以C结尾的片段:GATC,GATCC,产生的都是以G结尾的片段:G,GATCCG,产生的都是以T结尾的片段:GAT,GATCCGAT,.,制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的
人人文库> 全部分类> 教育资料 > 课件下载

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论