PCR扩增目的基因ppt课件_第1页
PCR扩增目的基因ppt课件_第2页
PCR扩增目的基因ppt课件_第3页
PCR扩增目的基因ppt课件_第4页
PCR扩增目的基因ppt课件_第5页
已阅读5页，还剩9页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

.,任务二：PCR扩增目的基因,.,一、实验目的,1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理2、学习PCR扩增仪的使用,.,二、实验原理,聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。,.,标准的PCR过程分为三步：1.模板变性（92-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.低温退火（37-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（72）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,.,.,三、实验仪器,PCR扩增仪台式高速离心机移液器高压灭菌后的Eppendorf管（0.5mL）电泳仪,.,四、材料与试剂,1、模板DNA（0.1g/L）：用牙签挑取单菌落悬浮到50L的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/LEDTA），95温浴10min，10000r/min离心5min，取2L上清液用于总体积50L的PCR反应。,.,2、TaqDNA聚合酶（5U/L），10扩增缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买。3、引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。,.,五、实验操作,1.准备PCR反应溶液,（1）按序将如下成分混合置于Eppendorf管内a.10扩增缓冲液10Lb.4dNTPs8Lc.引物11Ld.引物2Le.模板DNA1L（10ng）f.TaqDNA聚合酶L（2.5U）加水至终100L,.,（2）手指轻弹Eppendorf管底部离心2s,（3）加石蜡油50L封住溶液表面,.,2.PCR扩增反应,加好样的Eppendorf管置于PCR扩增仪内变性：955min951min退火：5545s延伸：721min重复循环30次循环结束后72延伸8min反应完毕，取样置-4待用,.,3.结果观察,取样进行琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭（EB）染色观察DNA条带,高度灵敏的荧光染色剂染色效果好操作方便稳定性差强致癌剂中度毒性,.,六、注意事项,1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，调整Mg2+浓度等。2、PCR反应特异性
人人文库> 全部分类> 教育资料 > 课件下载

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论