第三章-细菌的遗传与变异PPT课件

.,1,第三章细菌的生长和遗传变异,.,2,第一节细菌的生长及其特性,细菌在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，细菌大量繁殖，数量增多的现象叫做生长。这里的生长是细菌群体数量的增长。,.,3,细菌个体生长到一定阶段，就会以二分裂的方式形成二个子细胞，细菌个体数目增加，这种繁殖方式似乎与动植物的繁殖方式大不相同，但如果我们将细菌看作是一个植物的种子或动物的受精卵，把细菌繁殖产生的群体作为整体来考虑的话，细菌与其他生物则是完全相同的。细菌更像是一个“没有固定形状，没有组织分化，可分可合”的多细胞生物，更象是特殊植物，这里之所以说它是植物是因为只要给以合适的条件细菌也可以像植物一样永远生长下去。各类细菌都是抱团群居，研究表明群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌，同时群居的细菌还象高等动植物一样释放类似激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，并对环境产生影响，因此研究单个细菌的生长意义不大，通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细菌群体的生长规律，“生、老、病、死”。在介绍细菌的生长规律之前，先介绍细菌生长数量的测定方法。,.,4,一、细菌生长测定方法,（1）直接测定直接测定是常用的细菌生长测定方法，它借助显微镜直接观察计数，其优点是测定过程快速，缺点是不能区分细菌的死活。直接测定法根据不同的测定方法原理，可以分成以下几类：1.涂片染色法将已知体积(001ml)的待测样品，均匀地涂布在载玻片的已知面积内(1cm2)，经固定染色后，在显微镜下选择若干个视野计算细胞的数量，每个视野的直径和面积、对应的细菌体积用目镜测微尺测出，结合视野中的细菌数量从而推算001ml菌样的细菌数量。,.,5,涂片染色法,.,6,2计数器测定法,将菌液滴在血球计数板01ml的计数格中，细菌被固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。,.,7,例如数了125个小格中有90个细菌则(90125)0.0025=288个/ml菌液中细菌数目就为288个/ml。这种方法只能测定个体较大的细菌，细菌个体r若太小，则由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。若适当稀释，效果较好。,.,8,3比例计数法,将待测样品溶液与等体积的血液混合，然后涂片，在显微镜下测定细菌与红血球数的比例，因血液中的红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，由此可以测得细菌数量。,.,9,4比浊计数法,这是测定悬浮细胞的快速方法。其原理是细菌细胞是不完全透光的，光束通过悬浮液时会引起光的散射或吸收，降低透光度，在一定范围内透光度与溶液的混浊度即细胞浓度成正比，藉此可以测定细菌浓度。采用这种方法时；为了得到实际的细胞绝对含量，通常须将已知细胞浓度的样品按上述测定程序制成标准曲线，然后根据透光度或光密度值从标准曲线中直接查得细菌含量。,.,10,（1）制标准曲线,（2）测定菌液浊度，查表得出细菌数量,.,11,（二）间接计数法,间接计数法又称活菌计数法。它是通过测定样品中活的细菌数量来间接地表示细菌的含量。这种方法优点在于只计数样品中的活细菌数目，缺点在于测定所需的时间较长，手续繁琐。它分下述几种方法：,1.平板计数法将待测细菌样品先作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品涂布于固体平板培养基上，或与未经融化的固体培养基混合、摇匀，培养一定时间后观察并计数生长的菌数，最终根据细菌数和取样量计算出细菌浓度。,.,12,.,13,各取1ml，均匀涂布于固体培养基平板上,培养，每一个细菌会生成一个菌落,稀释度过小，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,.,14,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为100个则细菌数量=100/10-5=107个/mL平板计数法是采用最广的一种活菌计数法。,.,15,2.液体计数法,液体计数法是根据统计学原理设计的一种方法。具体做法是：先将待测菌液作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品分别接种到3管或5管一组液体培养基中，培养一定时间后，观察各管及各组中细菌是否生长、记录结果，再查与之匹配的统计表，即最可能数表(MPN)，算出细菌的最终含量。因此，这种方法又叫最可能数法或MPN法。,例如测定硫酸盐还原菌的数量，这种菌是厌氧菌，生长中形成了硫化氢气体，这些硫化氢会与铁生成大量黑色的硫化亚铁沉淀，在显微镜下这些沉淀很难与细菌区分；由于它是厌氧菌，不能在空气状态下生长，因此平板培养计数也无法使用，对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行液体培养，按MPN法进行计数。,.,16,（1）10倍梯度稀释,.,17,.,18,(3)统计、查表、计算,统计确定数量指标取生长的管数最多的且稀释度最高稀释度的生长管中生长的管数，为数量指标的第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数，就上例情况而言，3个重复生长的10-3和10-4两个稀释度，但两者中高稀释度的是10-4，其生长管数“3”为数量指标的第一位数字；第二和第三位数则为2和0。因此所得的数量指标为“320”。,查表所查的统计表是通过其他精确的计数方法，确定的各种数量指标时细菌数量的可能的最大值，在确定了数量指标后，可从MPN三管法统计表查相应的细菌最大可能数量。,.,19,MPN三管法测数统计表,上面例子中数量指标“320”对应的细菌最大可能数为9.5个菌/毫升。,杂质过多的污水不适宜用其他方法测定大肠杆菌，同样可以MPN法进行测定，除此之外，厌氧的铁细菌也只能用这种方法进行数量统计。,.,20,3.薄膜计数法,对于某些细菌含量较低的样品(如空气或饮用水)，可采用薄膜计数法。将待测样品通过带有许多小孔但又不让细菌透过的微孔滤膜，藉助膜的作用将细菌浓缩，再将膜放于固体培养基表面培养，然后类似于平板计数那样计算结果。这种计数法要求样品中不得含有过多的悬浮性固体或小颗粒。,（1）抽滤,.,21,（2）滤膜培养,（3）统计计数样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数例如上图测出5个菌落，抽滤了100ml自来水则自来水中的细菌数=5100ml=50个/L自来水上述各种活菌计数法中，根本原理都是利用一个细菌可以繁殖生成一个菌落的特点。因此被测的细菌都应处于均匀分散的悬浮状态。对于本身为絮体或颗粒状的细菌样品，如好氧水处理中的活性污泥，在测定计数之前要采取预处理方法(如匀浆器捣碎等)进行强化分散。,.,22,(三)重量法,细菌细胞尽管很微小，但是仍然具有一定的体积和重量，在细菌生长过程中，测定单位体积液体中细菌群体重量变化直接表示细菌生长数量的方法称为重量法。1.测定细胞干重法测定干重时，需先将细菌分离，再烘干称量。分离可采用离心法或过滤法。取已经培养一段时间的待测细菌样品，用离心机收集生长后的细菌细胞，或用滤纸、滤膜过滤截取生长后的细菌细胞，然后在105110下进行干燥，称取干燥后的重量，以此代表细菌生长量的多少。从细菌细胞的化学组分可知，干重约为湿重的1020。原核细菌的细胞重量是10-1510-11g/个细胞，真核单细胞微生物重量为10-1110-7g/个细胞。,.,23,水处理工程设施中的细菌生长量通常采用这种细胞干重测定法。这种方法实际上测得的是水中悬浮物重量，它是将细菌作为所有悬浮物来进行测定，如果水中非细菌类的悬浮物很多的话，势必会严重干扰细菌计数的结果。非细菌的悬浮物通常大部分是一些固体无机物及少量的油类等有机物，有机物与无机物在物理性质上有一个最大的区别，即在很高的温度下，有机物会被空气中的氧气彻底氧化为CO2和H2O，只留下非常少的残渣，而无机物化学性质稳定，高温下不会分解，这样我们可以利用高温灼烧的方法来区分细菌与固体无机物。,.,24,（1）悬浮物中绝大多数为细菌时,细胞数目=细菌群体的重量个体细菌的平均重量,.,25,（2）除细菌外还有大量无机悬浮物时,W1W2细菌群体的重量=W2W1细胞数目=细菌群体的重量个体细菌的平均重量,.,26,（3）除细菌外还有大量有机悬浮物时,过多的有机物悬浮物会对测定结果干扰很大，此时不能用重量法，应改用其他方法。总体来说重量法方法较之其他方法误差较大，一般只能作为粗率估计的计数方法。,.,27,2.细胞含氮量法,所有生物包括细菌细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般在1516，平均为16。根据样品中属于有机来源的氮含量测定结果，就可以求出细菌生长量的多少。这种方法首先确定三项已知数，细菌中的蛋白质平均含量、水样中的氮来源、水样中的有机氮含量。细菌中的蛋白质含量可以通过实验室纯细菌的分离破碎及氮含量测定来得出；水样中的氮来源可通过分析水的来源进行定性分析，如细菌培养液中起始的成分是无机氮化合物则水样中的有机氮都来源于细菌的蛋白质，这种情况下通过凯氏定氮测定出的有机氮含量就是细菌中的蛋白质含量，继而通过计算得出水中的细菌数量。细菌的数目=有机氮含量16%单个细胞的蛋白质含量如果水中非细菌的蛋白质比例过大，如屠宰厂废水及食品加工厂废水，这时细菌与游离蛋白质难以区分，这种方法不易参用。,.,28,3.DNA含量法,这种方法与细胞含氮量法思路是一样的，不同的细菌细胞DNA含量是不同的，但同种细菌的DNA含量却是基本一致。利用这一特性，可以通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量，故可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，用荧光比色或分光光度法测得DNA的含量。这种方法对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，通常只作为少量细菌纯培养时细菌数量的测定，条件合适时，这种方法的精确性是非常高的。,.,29,(四)其它生理生化指标法,细菌的生长生命活动过程中，不可避免地要吸收和消耗一些物质，同时产生和分泌另一些物质。测定这些物质的变化与细菌数量的变化有着直接的关系，通过测定这类物质的变化可以间接表示细菌生长的情况。水处理中通常采用的生理生化指标有：营养物质(COD)的消耗，溶解氧的消耗(如好氧细菌的瓦呼仪测定法)，有机酸的产生，H2和CH4的产生(如厌氧细菌的生长及活性测定)。利用这类方法时，首先要确定细菌的数量与这些物质变化的对应关系，作出相应的标准曲线。继而查表计算。,.,30,如好氧细菌，利用COD消耗速率与细菌数量的比例关系，由COD消耗情况判断细菌数量时，通常按如下方法进行（1）测定COD消耗速率与细菌数量的标准曲线分批细菌培养，固定时间取样测定培养条件下细菌数量与COD的值，作COD消耗速率与细菌数量的标准曲线。,.,31,（2）应用,实际中我们只需要测定COD的消耗速率，对照标准曲线查相应的细菌数量，这类方法的准确性受细菌种类、标准测定情况与实际水环境情况的可比性等因素的影响，一般只用于实验室细菌生理研究使用。以上细菌的各类测定方法各有长短，使用时应该根据具体情况加以选取。,.,32,二、细菌的生长特性,将细菌整个群体作为研究对象，来研究它们生长的特点就是我们这里所说的细菌生长特性，大体上可以分为两种情况，一种是间歇式培养（又叫分批式培养），另一种是连续式培养。一般通过测定细菌重量或数量随培养时间延续的曲线关系来考察细菌的生长特性。1.间歇培养和生长曲线通常情况实验室的细菌培养都采用细菌的间歇培养，这种培养只有开始时的一次投料和接种细菌，其余时间细菌根据环境变化自行生灭。这种培养方式主要用于细菌的生理特性研究。同时生物工程和废水生物处理中也有一些是以分批式反应器进行操作的。典型的细菌间歇式培养状态下细菌有下面一种共通的生长曲线特征。,.,33,（1）活细菌重量变化曲线,在培养的不同时间取一定体积菌液，通过死活细胞物理化学性质上的差别直接或间接的方法称量出活细胞的重量，得出单位体积菌液中活细胞重量与时间的变化曲线。在正常生长的情况，曲线关系如下图所示,.,34,生长速率上升阶段,细菌培养初期，营养物丰富，细菌同化作用旺盛，细菌数量呈级数增加，同时细菌开始在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大，活细菌的总重量也迅速升高，体现为重量生长速率随时间不断增大，这个阶段为生长速率上升阶段。,.,35,生长速率下降阶段,随着时间的延续，可利用的营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降，同时代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制，这些限制性因素还不是十分严重，细菌的同化代谢速度变慢，没有停止，因此活细菌的总体重量还是在不断升高。只是重量生长速率下降，但随着时间的延续，外界营养物越来越少，最终无可利用，细菌的同化作用停止。细菌总体重量不再变化，达到最大值。,.,36,内源呼吸及死亡阶段,外界营养物不足，细菌只能利用体内储存的能源物质进行内源代谢，以维持生命，活细菌个体不断消瘦，并开始出现饿死和被环境中的有害代谢产物毒死的现象。但活菌数量总体还会维持一个短时期的增长，这是由于尚有前期储备的营养物提供繁殖所需的物质和能量，然而也只是2=1+1，且1和1还在继续缩水，变为0.8、0.6,因此活细胞的总体重量是在下降。随着内部营养物的耗尽和外界有毒代谢产物浓度的进一步加大，更多的细菌死亡，死亡率超过了出生率，活菌数量下降，每个活菌的重量也由于内源代谢而不断下降，从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。,.,37,值得一提的是细菌总体不会在短期内完全死亡，死亡趋势不断减缓，这是由于死亡细胞分解释放出的细胞物质被作为残存细菌新的营养物，这种积极因素随着更多细菌的死亡而不断显著，个别细菌得以继续生长甚至繁殖，但不管怎样，从总体上看残存细菌的生存环境还是在不断恶化，活细胞重量的下降趋势是无法扭转的。以上就是封闭体系，细菌间歇式培养的生长情况，本质上与其他生物，包括我们人类都是一样的。这种以活菌重量反应的细菌生长曲线，能够清晰的反映间歇培养时，细菌的生老病死，但由于活细胞分离称重方法繁琐，细菌计数相对简单，因而实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线。虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途。,.,38,2细菌数量生长曲线,细菌数量的生长曲线大体趋势与活细菌重量法是相同的，如下图,（之所以细菌数目用其数量的对数值表示是由于细菌的数量很大，通常都是10的几次方，取对数作图时可以更方便一些）,总菌数,活菌数,.,39,（1）迟缓期,当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通常不立即进行细胞分裂、增殖，生长速率近于零，细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为迟缓期。,特征迟缓期是细胞分裂启动之前的恢复或调整期。而不是生长的休眠或停留期。迟缓期细胞的主要特征是代谢活跃，体积增大，从介质中快速吸收各种营养物质，大量合成细胞分裂所需的酶类，ATP和其他细胞成分，为细胞分裂作准备。由于细胞重量持续增大，因此重量图中没有类似的迟缓期。,.,40,产生原因,迟缓期可以很长，也可以很短甚至不明显。迟缓期的形成有多种原因。但都与接种细菌的状态有关。接种细菌时的状态大体有以下几种情况.接种生长对数期的细菌处于生长对数期的培养物被接种到与原先同样的生长条件和同样培养基中后，几乎能够以同样速率进行对数生长，迟缓期不明显；.接种生长稳定期或衰亡期的细菌如果被接种的是处于生长稳定期或衰亡期的培养物，即使此时培养物中所有细胞都是活的，迟缓期也会发生。这是因为稳定期细胞生理上已经衰老，其合成机制处于损伤状态，基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分，因而需要一定时间进行生理修复和物质的再合成。,.,41,.接种受损细胞如果接种菌是因热、辐射或有毒化学物质处理而受到损伤的细菌，迟缓期也会发生，因为细胞需要时间修复这种损伤。,.接种富集培养基的细菌当细菌被从营养丰富的培养基转移到营养贫乏培养基后，为了合成新培养基中所缺乏的某种营养物质以满足自身生长，结果也导致迟缓期的出现。此外，菌种的遗传特性和接种体积的大小也会影响迟缓期的长短。,.,42,在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的迟缓期，迟缓期的出现会增加操作时间，降低工作效率，此时我们可以通过增加接种量、采用最适种龄(处于对数期的菌种)、选用繁殖速率快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除迟缓期。,应用,.,43,（2）对数期,一旦细菌细胞的生理修复或调整完成，迟缓期即告结束，细胞开始进入快速分裂阶段。这一时期细胞数目的增加以2n级数进行，细菌的数目X的增长率只与细菌的初始数量有关。,故称对数期。相当于重量法细菌曲线的生长率上升阶段。,.,44,特点,对数期的细胞分裂速度最快、繁殖一代的时间最短、代谢活动旺盛、对环境变化敏感，并且细胞内的核糖体等组分也像细胞数目一样以同样的对数生长速率增加，细胞合成核糖体以及蛋白质越多，其生长速率也越快。不同细菌对数期的生长速率却变化很大，这与菌种本身的遗传特性有关，同时受环境条件(如温度、培养基成分等)的影响。,如大肠杆菌在20时其代时是35条件下的2倍；伤寒杆菌在含0125的蛋白陈水培养基中的代时为800min，而在含10时仅为40min。,.,45,细菌代时的计算,细菌的代时即世代时间，或称倍增时间是指细菌繁殖一代即个体数目增加一倍的时间。细菌在不同的生长期，不同培养温度、pH、营养物浓度和性质的情况下，倍增时间不一样，对数期的细菌细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，细菌数目呈几何级数增加，代时稳定，因此细菌代时的测定必须以对数期的生长细胞作为对象。其测定计算如下：,.,46,在对数期分别测定t0时刻与t时间细菌的数量X0与X，基于细菌的二分裂生长t0t122223（22）2）24252nX0X024X02n(n=1、2、3)Xn就是细菌的代数,.,47,（3）稳定期,如果对数期的细胞分裂不受节制的连续进行，理论上一个代时为20min。重1012g的细菌，经过48h的对数生长之后，其群体重量可达到地球重量的4000倍。然而由于营养物的有限，这种情况不会发生。在一个封闭的系统中，细菌的对数生长只能维持一个短暂的时期，最终生长将会降低，代时延长，细胞活力减退。此时新生的细胞数目与死亡的细胞数目相等，总菌数达到最大值，活菌数保持恒定。图中的生长速率为一定值，故将其称为稳定期。相当于重量生长曲线中的生长率下降阶段。,.,48,特征,稳定期细胞的特征是从生理上的年轻转化为衰老，表现为细菌的代谢活力钝化，细胞含有较少的核糖体，RNA和蛋白质合成缓慢，mRNA的水平低下，因此细胞的生长变得不平衡，细胞的形状有的也发生改变。因不能维持细胞壁的合成与修复，细胞的染色特点也发生变化，如G+转变为G。,但此时细胞的很多功能，如能量代谢和某些生物合成过程还在继续进行，生物化工中作为产品的某些细菌代谢产物如抗生素和某些酶就是在稳定期，特别是在对数期与稳定期转换阶段所产生的。某些细菌的芽孢产生也发生在稳定期。,.,49,（3）死亡期,如果处于稳定期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降，此阶段就被称为死亡期。相当于重量法的内源呼吸阶段。,.,50,特点,死亡期细胞的总数虽然镜检直接计数可能会保持不变，但间接菌落计数检测到的活细胞数目却在减少，同时伴随着细胞的裂解或自溶可释放出一些代谢产物，如氨基酸、转化酶、外肤酶或抗生素等。个体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内含很多的空泡，G+染色反应转变成G染色反应。,.,51,死亡期的长短与对数生长期一样在不同微生物中变化是很大的，主要与菌种的遗传特性有关。有些细菌的培养物经历所有的各个生长时期，几天以后死亡；另一些细菌培养物在几个月甚至几年以后仍然含有一些活的细菌。产芽孢的细菌其芽孢比代谢活跃的营养细胞更易于幸存下来。通过补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期的细胞死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。,.,52,3细菌生长曲线在污(废)水微生物处理中的应用,不同的废水生物活性污泥处理法中，其活性污泥中细菌的生长状态不同，或处于静止期，或处于对数生长期，或处于衰亡期，等等。在废水生物处理设计时，按废水的水质情况(主要是有机物浓度)，可利用不同生长阶段的微生物处理废水。,.,53,.,54,之所以利用的是细菌特定的生长阶段，是由于水处理大多为连续化操作，细菌处于一个相对稳定的环境中，细菌必然维持在一个与环境相适应的生长阶段。只有当环境发生变化时，细菌的生长状态才会发生变化。从这里可以看到细菌的连续培养与分批培养时的规律是不同的。,.,55,4.连续培养,连续培养与间歇培养不同，它的特点是一方面连续进料，另一方面又连续出料。它又分为两种：恒浊连续培养和恒化连续培养。,.,56,（1）恒浊连续培养,是一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长。通过控制进料流速使装置内细菌浊度保持一定，保持理论上的对数生长期，可获得大量菌体或与菌体代谢相平衡的代谢产物。这种方式往往用于细菌的生理生化研究。,.,57,（2）恒化连续培养,这种方式新鲜培养基以恒定的流速流入，与培养器内的培养基瞬间混合，培养器内的培养基继而也以相同的流速恒定流出，进水组分及反应器中营养物浓度基本不变，因而这种细菌培养称为恒化连续培养。除了分批式间歇曝气器(SBR)法外，其余的污水生物处理法均采用的是恒化连续培养。这种方式总是有一种限制性营养物控制生长。如碳源丰富，氮源相对不足；或碳氮源都很充足而微量元素相对较少等，限制性营养物的出现是一种必然现象，这是由于细菌生长时的营养物繁多，同时有着固定的配比，培养基或废水中的成分不可能如细菌所需要的那样正好匹配，因此出现这种或那种营养物的相对不足，而成为限制型因子，生产实践中，找出该限制因子是提高生物效果的关键环节。,.,58,稀释率,.,59,稀释率的影响,在恒化器中，由于稀释率大小不仅直接决定限制性因子浓度的多少而且有一冲淡的作用，细菌群体数目的净变化是细菌生长所引起的细胞数目增加与连续流入的新培养基稀释带出细菌引起的细胞数目减少的总增量。,细菌随排出液排出，细菌量减少,细菌生长，细菌量增加,.,60,稀释率的大小对细菌菌体生长的影响可以分为以下几种情况（如图中所示）,.,61,.当稀释率高于细菌的最大生长速率,稀释率很高时，进料流速太高，A点位置后，菌体数目在最大生长速率时的增加低于因稀释作用而使菌体数目减少的速率，则反应器内的细菌数量持续减少，最终容器中的细菌被流加的新培养基完全洗去。这一原理，常被用于特殊菌的筛选，当容器中有几种细菌时，在容器培养基环境中比较而言生长速率最大的细菌，随着稀释率的升高，必然是最后被洗出。例如为筛选能降解丙烯腈的细菌，我们可以先使培养基中唯一的碳源是丙烯腈，继而向容器中加入足够数量有潜在可能降解丙烯腈的混合细菌，逐步提高稀释率，此时完全不能利用丙烯腈生长的细菌由于生长速率最低，将首先被洗出，继而是能微弱利用丙烯腈的细菌，最后是能较好地利用丙烯腈的细菌，这样最后被洗出的细菌就可以被用于丙烯腈废水的生物降解工作中。,.,62,.当稀释率小于细菌的最大生长速率,稀释率太低时，A点以前，营养物的供给总量不足，细菌不能以最大生长速率繁殖，但细菌通过限制繁殖分裂的频率即代时，维持一个较对数期低的代时，这时反应器中的基质浓度维持不变，其中限制因子浓度保持不变，该浓度的大小就成为细菌数量变化的唯一制约因素，细菌数量将达到该浓度许可的最大量，由于细菌消耗营养物的成比例关系，基质中的浓度必然降到限制性营养因子耗尽时的平衡浓度，随着稀释率的提高，细菌的代时由于生存条件的改善提高，由于稀释率升高营养物流入反应器的重量增加而引起的细菌总量的提高部分全部从反应器中随流出液带出，反应器中的基质浓度与细菌的数量继续维持恒定，细菌生理趋向于对数期的最大生长速率。,.,63,.当稀释率等于细菌的最大生长速率,即A点位置，此时细菌的代时缩短到受自身遗传因素限制的最短时间，即对数期的代时，反应器中的细菌数目继续维持在限制性营养物浓度耗尽时的细菌最大数量并保持恒定。恒化反应器中细菌生长的规律提示我们，从尽可能地提高生物量的角度出发，废水的生物处理中，一定要调查清楚废水中的限制性因子是什麽，并设法改善，这样才可以在同样废水状态下，进一步的提高进水量，提高处理能力并保持细菌较高的数量和良好的处理效果。这对于挖潜增效，有着十分重要的指导意义。,.,64,第二节细菌的遗传与变异,所谓细菌的遗传性是指每种细菌所具备的亲代性状在子代重现，子代性状与亲代基本上一致的现象。1.遗传的保守性遗传的作用在于保持生物物种的存在和延续，并保持物种的相对稳定性。遗传引起的亲代与子代严格的相似性，称为遗传的保守性。,.,65,例,大肠杆菌是短杆菌，生活条件要求pH为72，温度37，在糖类物质存在的条件下产酸、产气。大肠杆菌的亲代将这些特性传给子代，这就是大肠杆菌遗传的保守性，其他生物也是如此。遗传的保守性程度即亲代与子代的相似程度与物种差异和个体生长状态不同有关，高等生物遗传保守程度比低等生物大。老龄菌遗传保守程度比幼龄菌大（这与老年人思想比年轻人保守倒是十分相似）。细菌遗传的保守性既有有利的一面也有不利的一面，当环境条件改变，细菌会因为遗传的保守性，不适应改变了的外界环境条件而死亡。,.,66,2.变异的多样性,任何一种生物的亲代和子代以及个体之间，在形态结构和生理机能方面都有所差异，这一现象叫做变异。变异是生物对环境能动适应性的表现。在新的生活条件下细菌基因突变，有些突变会产生适应新环境的酶(适应酶)，从而适应新环境并生长良好，基因突变是变异的分子本质。内在的变化必然带来外在的变化，细菌变异外在表现形式很多，例如：个体形态的变化，菌落形态(光滑型粗糙型)的变异，营养要求的变异，对温度、pH要求的变异，毒性的变异，抗毒能力的变异，生理生化特性的变异及代谢途径、产物的变异等。,.,67,3.遗传与变异的辩证关系,遗传与变异是所有生物包括细菌最基本的属性，两者相辅相成，相互依存，遗传中有变异，变异中有遗传，遗传是相对的，变异是绝对的，有些变异了的形态或性状，又会以相对稳定的形式遗传下去，但是并非一切变异都具有遗传性。,.,68,4遗传与变异的分子机制,与其他生物一样，细菌的遗传变异是由生物遗传物质DNA所决定的，有关DNA的生化知识我们在生物化学课中已作了详细介绍，此处只作一简单回顾。DNA是几乎所有生物的遗传物质，基因是DNA上指导细菌蛋白质以及RNA合成的DNA片段；DNA以及基因是由许许多多的核苷酸脱水通过磷酸二脂键相互连接而成的核苷酸聚合物，形成DNA的核苷酸主要有四种，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（C）、胞嘧啶（T）。这四种核苷酸，每三个为一组的不同组合顺序分别对应于特定的氨基酸，这样在DNA通过RNA间接指导细菌蛋白质的合成时，细菌DNA的特定核苷酸排列形式就反映在细菌蛋白质的特定氨基酸结构中。,.,69,我们知道蛋白质的氨基酸结构决定了蛋白质的功能，蛋白质的功能体现在催化细菌的一切生化反应，组成细胞结构等方面，蛋白质实际上对细菌生理起决定性的作用。由此不同细菌的不同DNA组成就间接决定了细菌的一切。DNA通过复制而将一模一样的DNA传给后代，这样DNA在复制并传递给下一代的稳定性，就体现为子代与亲代在各方面的相似性，也就是遗传的保守性。而子代细菌DNA组成上变异则必然引起子代功能与亲代的差异，也就是变异性。,.,70,决定决定（1）DNA蛋白质细菌的几乎一切复制（2）亲代DNA子代DNA决定（3）复制传递的稳定性遗传的保守性决定（4）子代DNA的变异变异的多样性,.,71,5细菌的选育与细菌的变异,废水生物处理中起决定性作用的自然是具有高效废物降解能力的微生物（主要是细菌），这些微生物菌种通常都是通过对自然界微生物的筛选与定向培育获得。细菌及其它微生物的筛选与定向培育就称为选育。细菌在自然界是混居的，从中挑选出符合我们需要的细菌就是细菌的筛选，一般而言筛选出来的细菌性能还不是十分理想，通常还需要定向培育，即通过有计划、有目的地控制微生物生长条件，改变细菌遗传性，使其变异为我们需要的理想的废物降解菌。,.,72,在水的生物处理中，这种定向培育过程通常又称为驯化。驯化方法的分子机制有两种，一种是诱导细菌处于休眠状态的功能基因复苏，产生相应得酶；另一种是改变细菌的基因；后一种又分为两条途径，第一条是利用细菌的基因突变，另一条则是人为对细菌进行基因重组改造。这里重点介绍细菌基因改造的驯化方法，我们首先介绍一下细菌的筛选，它是驯化工作的第一步。,.,73,(1)细菌的筛选方法,细菌的筛选方法原理是适者生存原理，利用选择性培养基从混杂的各种细菌中单独培养出能满足特殊需要的天然细菌。通常的筛选都是通过人为筛选与天然筛选相结合来进行的。例如筛选能降解石油的细菌。在长期被石油污染的土壤里，适应石油环境利用石油作为食物的细菌必然被天然筛选了出来，我们收集这种土壤样品在实验室用石油降解菌选择性培养基，对样品中的石油降解菌进行进一步的选择培养，筛选，富集，为下一步的驯化工作奠定基础。,.,74,（2）细菌的驯化,诱导法诱导法通过以毒性底物为培养基中的唯一碳源，并逐渐提高其浓度，促使细菌由于这种底物的长期缺乏而休眠的基因恢复活性，产生相应的降解酶，从而恢复对毒性底物降解的能力。这种方法主要常用于有机毒物降解菌的驯化。优点是操作简便，因而使用较为普遍，但由于受到细菌固有能力的限制，驯化的潜力有限。,.,75,基因突变法,能动地利用细菌基因突变原理进行细菌驯化的方法就是基因突变法。细菌的基因突变是细菌基因中的碱基组成、顺序的突然改变。能造成这种改变的因素很多，如因温度、紫外线、核辐射、酸、碱、人工诱变剂等自然和人为的因素，他们会造成DNA碱基丢失或DNA复制出现错配或DNA修复时出现差错，这些将引起基因突变，基因突变有这样几个特点。,.,76,A基因突变的特点,.无定向性无定向性是指突变的发生没有固定的方向。如在紫外线作用下，除产生抗紫外线的突变体外，还可诱发任何其他性状的变异。其他诱变因子也是一样，这样突变体发生后，既可能造成细菌的死亡，也可能使细菌获得了更适应环境的能力，没有特定的方向。对环境的适应程度将决定突变后的细菌能否生存、繁殖。.稀有性突变发生的频率很低，即稀有性。突变率是指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的机率，通常为10510-10。也就是说十万至一百亿个细菌中产可能有一个细菌的基因发生突变。.自发性细菌基因突变的发生可以在没有人为诱变因素的处理下自然发生。,.,77,.独立性某一基因的突变，既不提高也不降低其他任何基因的突变率，说明基因突变不仅对某一个细胞是随机的，而且对某一基因也是随机的。.稳定性稳定性是指由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。.可逆性突变可以由原始的野生型向突变型方向进行，称正向突变。也可以反过来，由突变型向野生型的转变，称回复突变。.诱变性自发突变的发生频率很低，但是通过人为施加诱变剂处理后突变率可大大提高，一般可提高10105倍。这是人工诱变情况下的基因突变特点突变利用基因突变的特点，人们通常通过人工诱变进行细菌的基因改造。,.,78,B诱变,人为地利用物理化学因素，引起细胞DNA分子中碱基对发生变化叫诱变。所利用的物理化学因素称为诱变剂。常用的诱变剂有紫外线、5溴尿嘧啶、亚硝酸、卟啶染料等。诱变的步骤为.制出发菌株的单细胞悬浮液为了使出发菌株均匀的接触诱变剂，应向细菌培养液中加入玻璃珠，并保持在诱变过程中始终进行振荡搅拌形成出发细菌的单细胞悬浮液；,.,79,.选择合适的诱变剂剂量进行诱变诱变剂对细菌而言都是毒药，量太少起不到诱变作用，量太大则会完全杀死细菌，因此每一种诱变剂在使用时都有一定的最佳剂量。例如在进行细菌紫外诱变时，通常使用15或20W的紫外灯距离细菌单细胞悬浮液1530cm，照射1520min。.筛选利用特制的选择性培养基再从各种突变体中筛选出我们需要的突变体，并进行富集培养。至此诱变的任务就算完成了，获得了理想的菌种，这种方法的潜力要远大于诱导法，但操作复杂，在实际诱变中，往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体。最后这些突变体将会在实验室小试、中试的基础上被投放到生产实践中。,.,80,通常生产上更多利用的是细菌的自发诱导与突变，而不采用基因诱变，如驯化活性污泥及生物膜的方法，一般是把培养、选择、淘汰结合在一起，在特定废水中有些菌种不能适应被淘汰，能产生诱导酶的菌株及自发突变体中能来降解此类废水的菌种能够生存而被保留下来，同时大量繁殖，使废水达到预期的排放标准；另一方面，国外目前正在研究针对某种废水用人工诱变方法筛选大量具有很强分解能力及絮凝能力的菌株，并把它们做成干粉状的产品，如同市面出售的酵母干粉一样，这时细菌处于休眠状态。当工厂处理此类废水时，可把干粉状菌种置于30水中溶解30min，使细菌恢复活性，不必再驯化，对所需处理的废水有较好效果。,.,81,基因重组法,A.定义基因重组法是利用人工手段，将供体细胞DNA融合入另一个细胞的DNA中，使受体细胞基因重新排列，并出现植入DNA基因对应生物特性的细胞改造方法。基因重组是两种DNA的拼接，不发生任何碱基对结构上的变化。这是与基因突变最大的不同之处。B重组形式基因重组同样有自发的基因重组与人工的基因重组之分，二者的原理本质上是完全相同的。微生物中基因重组的形式很多。在真核微生物中，基因重组是通过二个配子相互融合的有性繁殖的过程中发生的，故称为杂交。在细菌等原核微生物中通常只是部分遗传物质的转移和重组，如转化、转导和接合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,.,82,.转化,转化(Transformation)是供体细胞研碎物中的DNA片段直接吸收进入活的受体细胞的基因重组方式。受体细胞获得了供体细胞的部分遗传性状。转化现象是1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现的。为纪念格里菲思先生当时发现这一现象的实验被命名为格里菲斯实验。,.,83,格里菲斯实验,.,84,1928年英国细菌学家格里菲斯(Grifftll)发现肺炎双球菌中S型菌株，菌落光滑，产生荚膜，当它感染人、小白鼠或家免等时均可致病。其中R型菌株菌落粗糙，不产生荚膜物质，感染人、小白鼠或家免均不致病。当将R型活菌注射小白鼠，小白鼠健康不致病，并可从健康的鼠体分离到R型肺炎双球菌菌落；将S型的肺炎双球菌注射小白鼠，小白鼠被杀死，从小鼠体内会分离出S型的肺炎双球菌；将加热杀死的S型细菌破碎细胞注射入小鼠细胞，小白鼠健康不致病，小鼠体内没有S型细菌；将加热杀死的S型细菌与R型活细菌混合后注射小白鼠，小白鼠死亡，并可从死鼠体内分离到S型活细菌。当时虽然发现了这一有趣的现象，但并不知道其中的原因。,.,85,1944年才通过试验找出了其中的原因。试验方法如下：,.,86,细菌转化过程可大体分为以下几步：感受态细胞的出现吸附外源DNA片段外源DNA进入细胞内受体DNA解链形成受体DNA供体DNA复合物DNA复制和分离其中感受态细胞的出现是关键。所谓感受态细胞是能吸收外来的DNA片段，并能把它整合到自己的染色体组上以实现转化的细胞。感受态细胞是由遗传性决定的，也受细胞的生理状态、菌龄、培养条件的影响。目前发现自然状态下许多其它细菌、放线菌、真菌和高等动植物中都也有转化现象。,.,87,.接合细菌的接合是细菌遗传物质染色体DNA片段或质粒DNA通过细菌与细菌的直接接触而进行的转移和重组的现象。在第一章细菌的繁殖一节中，细菌的有性繁殖实际上就是这里所说的结合，有关内容在此不再重复。,.转导遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组现象称为转导。转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。,.,88,.,89,实验中L-22细菌这一侧出现（A+B+）菌，L-22菌是如何获得色氨酸合成功能的呢？研究发现LA22在培养过程释放温和的噬菌体P22，P22通过滤板侵染供体LA2，当LA2裂解后，产生“滤过因子”大部分是P22，其中极少数在成熟过程包裹了LA2的DNA片段(含合成色氨酸的基因)，并通过滤板再度感染LA22，使LA22获得合成Tru能力，由噬菌体携带来的DNA片段与受体细胞的基因重组，这个现象称为转导作用(有关温