基因工程的主要技术与原理PPT课件

,第四章基因工程的主要技术及原理,1,.,核酸的提取与纯化,核酸电泳,分子杂交,PCR技术,DNA序列分析,大分子相互作用,2,.,分子杂交(molecularhybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P或125I)、生物素或荧光酶等）探针（DNA、RNA或蛋白质）进行相同或不同种类分子间相互特异识别而发生结合的过程。,第三节核酸和蛋白质的分子杂交,支持物不同,分子杂交分类,3,.,分子杂交流程图,样品制备,电泳,杂交,转膜,结果显示,探针/抗体制备,按片断长短进行分离,凝胶中的片段转移到固相支持物,DNA/DNADNA/RNA抗原/抗体,提取DNA/RNA/蛋白,放射自显影荧光检测显色技术,4,.,一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。,根据标记物不同可分为放射性探针和非放射性探针两大类；放射性标记物（-*N-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d)非放射性标记物,一、核酸探针,5,.,非放射性标记物的种类,半抗原：地高辛，利用半抗原的抗体进行免疫学检测。配体：生物素，是一种抗生物素蛋白avidin和链亲和素streptavidin的配体。荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。光密度或电子密度标记物：金、银,根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。,6,.,寡核苷酸探针（oligonucleotidprobe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA或RNA分子的存在。,常用寡核苷酸探针的标记物,放射性同位素标记：32P、33P、35S,非放射性标记：生物素、地高辛,生物素dUTP、生物素dATP、地高辛dUTP等,7,.,（一）、探针的标记物,非放射性探针的标记,生物素标记核酸（光敏生物素、酶促生物素）,DNA半抗原标记荧光素标记,8,.,以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。,生物素标记法,基本原理：,9,.,生物素-抗生物素蛋白-酶(Avidin-Biotin-Enzyme-Complex)ABC荧光标记,10,.,地高辛dUTP,杂交探针的标记：DNA半抗原标记-地高辛系统标记,11,.,地高辛（Digoxigenin，DIG）是一种类固醇半抗原，来源于植物(Digitalispurouren和Digitalislanta)的花和叶中，其他生物体中不含有地高辛抗体DIG可以与dUTP反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。,原理：,12,.,两种地高辛dUTP显色系统,13,.,非放射性核素探针的检测偶联反应半抗原:通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。配体:亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex，ABC）,显色反应,通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。,14,.,（二）、核酸探针的常用标记方法,核酸探针的标记几乎总是先将脱氧单核苷酸底物标记相应的信号，然后利用核酸合成的方法合成具有标记信号的核苷酸链,15,.,放射性探针的标记,缺口平移法（nicktranslation）,PCR法,DNA快速末端标记,T4多核苷酸激酶标记DNA5末端,随机引物延伸,16,.,由DNase和大肠杆菌DNA聚合酶共同完成。,DNase：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3-OH端,大肠杆菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶活性；53外切核酸酶活性,（1）缺口平移标记法（nicktranslation）,17,.,随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096,DNA聚合酶Klenow片段53DNA聚合酶活性弱35外切核酸酶活性无53外切核酸酶活性,（2）随机引物法（randompriming）,18,.,产物平均长度为400-600个核苷酸。Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。,制备高比活性探针(1010cpm/gDNA);,19,.,（3）末端标记法T4DNA聚合酶,53聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍35外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min,适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。,补平或标记DNA分子由核酸内切酶产生的3凹端对带有3黏性末端或平末端的DNA片段进行标记，制备探针,20,.,二、Southern杂交(Southernblotting),基本原理将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。,21,.,目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳,0.4NNaOH变性1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）中和使DNA仍保持单链状态,将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上通过80处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上,将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附,杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上,洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去,检测：放射性标记、检测非放射性标记、检测,22,.,分子杂交炉,紫外交联仪,23,.,三、Northern杂交(Northernblotting),基本原理,Northernblot是在变性条件下将待检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。定性分析mRNA的常用方法,用于分析基因转录与否以及转录水平的变化，比较两个或以上不同组织或细胞某一已知基因转录水平的差异,24,.,三、Northern杂交(Northernblotting),1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性;不能用碱变性，防止水解。用甲基氢氧化银、乙二醇或甲醛变性。3、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理4、靶核酸为RNA5、探针可用DNA或RNA片段,25,.,甲醛变性电泳：RNA变性，消除RNA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。,26,.,四、Western杂交(Westernblotting),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗体对蛋白质进行鉴定及定量的方法免疫印迹（immunoblotting）Westernblot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。可用于分析蛋白质水平的变化,27,.,四、Western杂交(Westernblotting),经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗,基本原理,28,.,主要步骤：,蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标，二抗）反应显色反应：酶促反应,四、Western杂交(Westernblotting),29,.,30,.,三种分子杂交技术的比较,Southern,Northern,Western,31,.,五、原位杂交(insituhybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,细胞或组织的固定后置于载玻片上组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测,基本步骤,32,.,菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用,基本程序是：将被筛选的大肠杆菌菌落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中转移到硝酸纤维素滤膜上，进行适当的温育，保存原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。,33,.,复制平板和膜转印时应在平板和膜上的一侧做三个对应的标签,0.5MNaOH裂解细菌酸中和蛋白酶处理漂洗细胞碎片80烘烤,与32P-标记的探针杂交,放射性自显影,在参照平板上挑取目标阳性克隆（阳性菌落）扩大培养,菌落原位杂交,34,.,一、PCR技术,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外扩增的一种方法,AppliedBiosystemsGeneAmpPCR9700Thermocycler,第四节聚合酶链式反应技术,35,.,二、PCR技术基本原理和操作,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,基本反应步骤,变性,退火,延伸,变性,1.PCR技术基本原理,36,.,模板DNA的变性模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备,模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,引物的延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,37,.,预变性,模板DNAdNTP引物Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5min,模板DNAdNTP引物Buffer,38,.,Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer,9430s551min722.5min,Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer,72710min,循环2535次,39,.,第二轮扩增,第三轮扩增,第一轮扩增产物,目的基因,目的基因,40,.,41,.,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用下面的公式计算。,PCR反应动力学,Y(1X)n,Y：代表DNA片段扩增后的拷贝数X：表示平均每次的扩增效率n：代表循环次数,平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值,42,.,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝,反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应,43,.,44,.,2.PCR的特点,操作简单省时：1-2hr灵敏度高：pg特异性强对原始材料质量要求低有一定程度的单核苷酸错误掺入,45,.,三、PCR技术的反应体系、条件和过程,引物、酶(热稳定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液,PCR反应的基本成分,10扩增缓冲液,KCl500mmol.L-1Tris-HCl100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl15mmol.L-1明胶0.1%,在延伸温度（72）下，pH值接近7.2，二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用1.5mMMg2+，有时使用Mn2+。dNTP都能结合Mg2+，因此Mg2+的浓度要大于dNTP，KCl对扩增大于500bp长度和改善DNA片段产物是有益的,46,.,标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP（终浓度：250mol/L）,dNTP,酶及其浓度,SelectionforDNApolymeraseKlenow酶，早期采用，该酶不耐热，缺点有温度要求低(37)，受热即失活；产物特异性不高；积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）,47,.,thermostableDNApolymerasesTaqDNApolymeraseTthDNApolymerasefromT.thermophilusVENTDNApolymerasefromT.litoralisSacpolymerasepfupolymerase,TaqDNA聚合酶,分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg,48,.,如何选择最合适的DNA聚合酶PCR实验的不同需求,特异性：基因组扩增、RT-PCR保真性：基因筛选、测序、TA克隆长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测,49,.,特点：,35核酸外切酶活性，降低碱基错配率,用途：,表达基因的克隆,基因的定点突变,细胞内基因点突变分析（SNP）,高保真酶,50,.,高保真高扩增效率,混合酶,热启动耐热聚合酶35核酸外切酶,用途,超长片段扩增、测序构建基因图谱复杂模板扩增：GC含量高、二级结构,51,.,引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。,引物,设计引物的原则,引物长度：16-30bp，常用为20-24bp左右引物的有效长度不能大于38bp，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（72），不能保证PCR扩增产物的特异性,52,.,引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段,引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带,53,.,引物3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败,引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,54,.,引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,引物的解链温度两个引物之间的Tm值差异最好在2-5,Tm值的定义，是两段互补的碱基序列解链50%时的温度,55,.,设计引物的方法,设计引物的操作流程,同源性比较,序列下载,引物设计筛选,根据所需要检测的基因在/pubmed查询有关序列,利用primerpremier5.0等软件进行设计和筛选,56,.,PCR反应条件的选择,温度与时间的设置,三温度点法,双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸,(标准反应),二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。,较短靶基因(长度为100300bp)时,57,.,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93941min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,变性温度与时间,58,.,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。,退火(复性)温度与时间：,59,.,引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,60,.,延伸温度与时间：,PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,61,.,循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,循环次数,62,.,RT-PCR（reversetranscriptionPCR）,RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法,原理通过合适的引物，将细胞内的RNA（一般为mRNA)逆转录成cDNA然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。获得的dsDNA可通过测序获得目的基因，也可用于基因操作。,63,.,荧光实时定量PCR(fluorescenceQuantifiedrealtimePCR),实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,64,.,PCR实验操作过程,65,.,PCR产物纯化,66,.,PCR产物纯化试剂盒,67,.,PCR产物电泳,PCR常见问题,正对照有条带，而样品则无,原因：,该Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解模板:含有抑制物，含量低反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,优化,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,68,.,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,原因：引物特异性差酶纯度不高Mg2+浓度偏高退火温度偏低Buffer不合适循环次数过多解决：重新设计引物或者使用巢式PCR换用高纯度的酶降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法更换Buffer减少循环次数,69,.,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态,原因：酶量过多模板不纯循环次数过多dNTP、Mg2+浓度偏高退火温度偏低Buffer不合适解决：适量用酶纯化模板减少循环次数适当降低dNTP和镁离子的浓度适当提高退火温度更换Buffer,70,.,假阳性,现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,71,.,第五节DNA序列的测定,DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。A.双脱氧链终止法(Sangerdideoxyprocedure)是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B.化学降解法（Maxam-Gilbertprocedure），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。,72,.,FrederickSanger,一、双脱氧法测序(Sangerdideoxyprocedure),双脱氧法测序原理,利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。,73,.,基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3-末端。因为ddNTP3不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。,74,.,具体操作：,测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了