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文档简介

,PCR技术原理,厦门艾德生物医药科技有限公司,定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。,PCR技术,DNA的变性在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。DNA的复性在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。,DNA的特性,最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，不耐高温。TaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。,PCR的发展,DNA样品的变性引物的退火引物的延伸,普通PCR原理,PCR反应要素,缓冲液：起PCR反应的缓冲体系Mg2+：Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少dNTP：dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低引物：引物是PCR特异性反应的关键酶：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一,引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增设计原则引物长度、引物扩增跨度、引物G+C含量、TM值、引物的特异性、引物量,引物,PCR反应条件,温度变性温度：双链DNA在9095变性退火温度：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素延伸温度：延伸温度：一般选择在7075之间时间：时间过长会导致非特异性扩增循环次数：循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,PCR结果的分析,普通PCR跑电泳分析荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针Taqman探针MolecularBeacons分子信标蝎子引物探针双环探针,激发光,发射光,SYBR
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