PCR污染的产生及防治

聚合酶链反应污染的产生和预防，聚合酶链反应实验室污染的特征和概念：由于各种原因，非目标检测样品本身的模板出现在聚合酶链反应扩增系统中，使聚合酶链反应结果假阳性。聚合酶链反应实验室的污染不同于一般生物安全实验室的污染。聚合酶链反应污染总是产生假阳性结果。聚合酶链式反应流程、样品制备、聚合酶链式反应执行、后聚合酶链式反应分析、聚合酶链式反应污染途径、操作错误或错误导致的样品间交叉污染污染污染聚合酶链式反应试剂、污染聚合酶链式反应实验设备的污染气溶胶、聚合酶链式反应污染的四个来源、样品或模板间交叉污染导致的聚合酶链式反应扩增产物污染、实验室克隆质粒污染、聚合酶链式反应污染的原因，以及当样品或模板间的交叉污染容器被污染的样品或模板放置时，样品核酸模板的交叉污染是由于容器外的模板密封松动和粘贴造成的。在提取过程中，由于样本抽吸枪污染造成的样本之间的污染会导致由于气溶胶或其他原因造成的移液器污染，从而导致交叉污染。一些微生物样品，尤其是病毒，会随着气溶胶或气溶胶的形成而扩散，导致相互污染和聚合酶链反应污染。在聚合酶链反应试剂的制备过程中，由于移液管、容器、水和其他溶液的存在，试剂会被聚合酶链反应核酸模板污染。聚合酶链反应污染的原因聚合酶链反应产物污染最重要和最常见的聚合酶链反应产物具有大的拷贝数(一般为10-13拷贝/毫升)，这远远高于聚合酶链反应检测到的几个拷贝的限度。非常少量的聚合酶链反应产物污染会形成假阳性。移液器吸取用于电泳检测的聚合酶链式反应产物，同一移液器制备聚合酶链式反应产物的气溶胶污染：据计算，一个气溶胶粒子可包含48，000个拷贝，因此由其引起的污染是一个值得特别注意的问题。气溶胶：由悬浮在气体介质中的固体和液体微粒形成的胶体分散系统，微粒大小为0.001微米至1，000微米.空气摩擦液体表面时会形成气溶胶。在操作过程中，反应管剧烈摇动。当盖子打开时，当样品被吸取时，以及当移液管反复吸取样品时，会形成气溶胶。聚合酶链反应污染的原因是分子生物学实验室和一些使用克隆质粒作为阳性对照的测试室。这个问题也更常见。此外，在纯化过程中需要更多的工具和试剂。此外，活细胞中的质粒很可能被污染，这是因为活细胞的生长和繁殖简单，并且它们具有很强的生命力。为了监测聚合酶链反应污染，一个好的实验室应该始终注意监测污染，并考虑是否有任何污染和什么造成污染，以便采取措施，防止和消除污染。经过30个循环后，检测的灵敏度对聚合酶链反应的强大扩增能力有所提高。理论上，特定的DNA片段的数量可以增加109倍，并且极少量的污染可以导致假阳性，特别是在定量方面引起很大的问题。NTC (NTC(注意模板对照):必须建立一个对照反应，该反应不包含模板DNA，但包含聚合酶链反应系统中的所有其他成分。阳性对照：是PCR反应成功和产物条带的位置和大小是否符合理论要求的重要参考标记。然而，阳性对照，尤其是重组质粒和高浓度阳性样品，很有可能污染检测或扩增的样品。应小心防止交叉污染。2.阴性对照：在每次聚合酶链反应实验中必须进行阴性对照。它包括：阴性样品对照(NTC):被测样品为血清，以鉴定的正常血清为对照。如果要检查的样本是组织细胞，则使用相应的组织细胞作为对照。(2)试剂空白):聚合酶链反应试剂无模板核酸或核糖核酸，进行聚合酶链反应扩增，以监测试剂是否污染。3.重复性测试4。从不同地区选择引物进行聚合酶链反应扩增和污染防治。在聚合酶链反应操作过程中，操作人员应严格遵守一些操作程序，以尽量减少可能的聚合酶链反应污染或防止污染。主要包括：(1)划分操作区域(2)分装试剂(3)实验操作注意事项，划分操作区域-理想的聚合酶链式反应实验室分区，防止污染-分装试剂，聚合酶链式反应扩增所需的试剂应在装有紫外灯的洁净工作台上或负压工作台上制备分装。所有的样品施加器和吸头都应该固定在里面，不能用来吸收扩增的DNA和其他来源的DNA。无污染检测设备无污染耗材聚合酶链反应水应为高压双蒸水。在没有扩增产物的区域，用高压双蒸水制备引物和脱氧核糖核酸。底漆和dNTP应分开存放，重新包装时应标明时间，以防污染。防止污染实验操作的预防措施。尽管大多数扩增序列的残留污染是假阳性反应的原因，但样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要仔细进行扩增反应，还要注意样品收集、提取和扩增的各个环节：1。制备样品时穿戴干净的工作服和手套，避免工作服和手套被聚合酶链反应产品污染；2.佩戴一次性手套，发现手套被污染时应立即更换；实验结束后离开工作场所时，脱下手套，放在一个特殊的垃圾桶里。3.使用一次性吸头。严禁在聚合酶链反应产品分析室将其与吸头混合。吸头不应长时间暴露在空气中，以避免气溶胶污染。4.准备好自己使用的聚合酶链反应试剂，并将其分成小份。不要与样品一起存放；防止污染-实验操作的预防措施。5.轻轻打开管子，防止液体溅出管子。如果不小心洒在手套或桌面上，请立即更换手套，并用稀酸擦拭桌面；所有含有质粒模板和聚合酶链式反应产物的电泳管在脱帽前都要高速离心1-3分钟。6.最后加入反应模板，加入后将反应管盖紧；7.在操作过程中设置阴阳对照和空白对照，可以验证聚合酶链反应的可靠性，有助于判断扩增系统的可靠性。8.由于样品加料器最容易受到产品气溶胶或样品DNA的污染，因此最好使用可更换的或高压处理的样品加料器。如果没有这种特殊的加样器，至少加样器应在聚合酶链反应操作期间专用，不能交叉使用，尤其是用于聚合酶链反应产物分析的加样器不能到达另外两个区域；防止污染-实验操作的预防措施9。禁止将聚合酶链反应产品带到制备聚合酶链反应系统的地方；禁止在制备聚合酶链反应系统的地方操作质粒和含有克隆质粒的菌液。10.从带盖子的容器中取样时，请将盖子拿在手里或确保放在不污染周围环境的干净地方。11.尽量确保反应系统和试剂在密封的容器中；12.聚合酶链反应完成后，尽量减少打开密封反应系统的机会；如果必须打开，应在单独的专用房间中打开。13.实验后或定期清洁工作台和仪器。污染预防-移液器操作，移液器操作由于操作过程中不小心将模板吸入枪内或粘在枪头上，是一个严重的污染源，所以添加样品时要非常小心。1)用于聚合酶链反应制备的专用移液器2)样品吸取应缓慢，并应在样品吸取过程中尽可能一次完成。避免多次吸入，不要形成喷雾，以避免交叉污染或气溶胶污染。3)最好在加入所有其他反应组分后加入模板。4)建议在准备聚合酶链反应时使用药筒枪头。防止污染第一个原则是始终设置非关税壁垒控制。如果在污染发生的第一时间找不到NTC控制，将导致严重的后果：在很长一段时间内，数据不可信。用于制备聚合酶链式反应的移液管不得用于通过吸取聚合酶链式反应产物/克隆质粒制备聚合酶链式反应系统，并且必须跟踪污染源。设置阴阳控制有利于监测反应系统各组成部分的污染。当选择阳性对照时，sa追踪污染源环境污染，除了消除试剂污染的可能性，更换试剂，如果很快发现试剂被污染，如果预防措施比较严格，考虑可能是环境污染。环境污染中常见的污染源有：1。样品进料器；2.电泳装置；3.切胶刀或手术刀片；4.离心机；5.冰箱门把手、冰柜、门把手或实验台面等。6.气溶胶。选择含有UNG的试剂(尿嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶尿嘧啶-N-糖基化酶)有助于防止由聚合酶链反应产物引起的污染。UNG: 50摄氏度，2分钟，作用于含有脱氧核糖核酸的双链或单链脱氧核糖核酸，然后开始聚合酶链反应的预变性步骤，同时去活化，用去活化酶控制污染，对没有脱氧核糖核酸的聚合酶链反应产物无效，污染处理-反应液污染，问题：-聚合酶链反应产物越长，方法的效率越高，产物小于100bp，效果不完全；-影响聚合酶链反