分光光度法课件

分光光度法,1,常规监测室,1、预处理2、取水样10mL稀释到50mL，加入1.0mL酒石酸钾钠，摇匀，加入1.0mL纳氏试剂（上清液），显色10min，于420nm，2cm比色皿比色，得到吸光度。3、实验需同时进行平行、加标实验。4、用实验得到的吸光度，录入系统，对比标准曲线，得到水样的氨氮浓度。,氨氮分析步骤：,1概述2光吸收的基本定律3分光光度仪器4显色反应与显色条件的选择5分光光度法仪器测量误差及其消除6质量控制7分光光度计使用注意事项,基本内容,3,一、概述,分光光度法又名吸光光度法，是建立在物质对光的选择性吸收的基础之上的分析方法。利用有色溶液对可见光的吸收进行定量测定，称为比色法。,4,比色法：利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质的浓度,分光光度法：用分光光度计进行的比色分析的方法,5,(1)方法灵敏度高：测定下限可达103106mol/L。(2)方法的准确度能满足微量组分测定的要求。(3)操作简便快速，仪器设备简单。(4)应用广泛:几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。,分光光度法的特点,6,物质对光的选择性吸收,（1）.光的基本性质,电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。,肉眼可见,7,（2）、物质对光的选择性吸收,当光通过透明的物质时，具有某种能量的光子被吸收，而另外能量的光子不被吸收。光子是否被物质吸收，既决定于光子的能量，又决定于物质的内部结构。,8,仅当照射光的光子的能量与被照射物质粒子的基态和激发态的能级差相当时才能被光吸收。,基态激发态E1E2,M+hM*,M+热,M+荧光或磷光,分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同。,9,互补色光,10,互补光：透射光与吸收光组成白光，故称为互补色光,不同颜色的可见光波长及其互补光,11,物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。,即物质的颜色由透过光的波长决定,溶液的颜色：被吸收光色的互补色,12,13,完全吸收,完全透过,吸收黄光,光谱示意,表观现象示意,复合光,蓝光,无色,黑色,物质的颜色与光的关系,（3）、吸收光谱或吸收曲线,吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。,max,14,（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max。（2）对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,吸收曲线的讨论,15,（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在max处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。,16,二、光吸收的基本定律,朗伯-比尔定律,（1）、朗伯比尔定律,一束平行单色光照射透明溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。,17,.朗伯定律(Lambertslaw),.比尔定律(Beerslaw),A：吸光度,18,朗伯-比尔定律,A=lg(I0/It)=Kbc,A吸光度(absorbance)b介质厚度(length/cm)c浓度(concentration)K吸光系数(absorptivity),T透光度(Transmittance),A=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT=Kbc,T:透过光强度It与入射光强度Io之比。,19,（2）、比例常数K,吸光系数a,A=bc,在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。,20,越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。105：超高灵敏；=(610）104：高灵敏；2104：不灵敏。,分光光度的灵敏度,与温度、波长及吸收物质本身的性质有关，与吸收物质浓度无关。,21,对朗伯-比尔定律的偏离,散射光的影响胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿产生正偏差。,（1）、物理因素,单色光不纯，导致负偏差,22,吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（c10-2molL-1)。,平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构及化学变化引起的偏离，如：Fe(SCN)3=Fe3+3SCN-Cr2O72-+H2O=2CrO42-+2H+,（2）、化学因素,23,24,三、分光光度法及其仪器,分光光度计内部光的传播途径,25,（1）.光源(Lightsource)：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)（2）.单色器(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜光栅玻璃3503200nm,石英1854000nm,26,（3）.吸收池(cell):用于盛待测液及参比溶液,玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区石英不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,（4）.检测器(detector)：利用光电效应，将光能转成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管,27,（5）.读数指示器,把光电流放大的信号以适当方式显示或记录下来。通常使用悬镜式光电反射检流计测定产生的光电流。检流计光点偏转刻度直接标为吸光度和透光度，测定时一般可直接读出吸光度。,28,四、显色反应与显色条件的选择,显色反应在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分M转变为有色化合物MR，然后再进行测定。使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫显色反应。所用试剂称显色剂。M(待测物)nR(显色剂)MRn(有色化合物)显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。,29,对显色反应的要求1）、灵敏度高选择较大的显色反应（一般要为104105）。避免共存组分干扰。2）、选择性好显色剂只与被测组分反应。3）、有色物组成固定Fe3+磺基水杨酸三磺基水杨酸铁(黄色)（组成固定）Fe3+SCN-FeSCN2+、Fe(SCN)2+（组成不固定）,30,4）、有色物稳定性高，其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的Kf=1042,F-、H3PO4对它无干扰。,5）、显色过程易于控制，而且有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。,31,显色反应条件的选择（实验确定）（1）、显色剂的用量，适当过量,M+R=MR(被测组分)(显色剂)(有色化合物)R过量，反应完全，MR稳定，A值稳定。,32,适宜的用量通过实验求得(cM、pH一定),吸光度A与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。,33,（1）对金属离子的影响（2）对显色剂浓度的影响（3）影响配合物组成（4）配合物的稳定性的影响（5）影响显色剂的颜色,2）.酸度,M+L=ML,34,（cM、cR一定）,pH1pHpH2,pH,35,3）、显色时温度和时间,4）、溶剂的影响，有机溶剂会降低有色物的离解度，从而提高显色反应的灵敏度。,36,影响主要表现干扰离子本身有颜色。与试剂生成有色配合物。与试剂形成无色配合物而消耗显色剂与被测离子生成离解度小的化合物。,5）、干扰物质的影响及消除,37,(3)改变干扰离子价态，测Ni2+时，Fe2+有干扰，加入氧化剂，Fe2+Fe3+.,(4)分离干扰离子，用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法。,还可选择适当的参比溶液和入射光的波长等方法来消除共存离子的干扰。,(2)加入掩蔽剂，如用SCN-测定Co2+时，Fe3+有干扰，加入F-:Fe3+6F-=FeF63-;Fe3+被掩蔽。,常用消除干扰的方法,38,(1)控制酸度，使干扰离子不显色。,五、分光光度法仪器测量误差及其消除,（545nm）,入射光波长的选择,原则：灵敏度最高，干扰最小。一般选择max为入射光波长。,39,光度计读数范围的选择,任何型号的分光光度计均有一定的读数误差,这是由于光源不稳定,读数不准确等因素造成的.,一定型号的分光光度计透光度读数误差是一常数.（0.2%2%）,在不同的透光度读数范围内引起的浓度相对误差是不同的.,由Lambert-Beer定律可推导出浓度相对误差公式.,透光率读数的准确度是仪器精度的主要指标。,40,测定结果的精度常用浓度的相对误差dc/c表示。,41,测量误差不仅与仪器的透光度的T有关，而且与其透光度的读数T值也有关。,42,若透光度刻度的读数的绝对误差为T=1%，用不同的T代入上式，可得相应浓度测量的相对误差c/c，作图。,43,2、T在20%65%(A=0.20.7)范围，相对误差较小。,1、T=36.8%(A=0.4343)，相对误差最小。,由图可见：,为了减小浓度的相对误差，提高测定的准确度，一般应控制溶液吸光度A在最适宜读数范围1.00.15。,44,参比溶液的选择,在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶剂称为参比溶液或空白溶液。,A总A试剂A显色剂A干扰A络合物,溶剂缓冲剂,干扰,干扰与显色剂形成络合物,被测物与显色剂生成,选择参比溶液的总原则是:使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度.,45,(1)试样、试剂、显色剂都无色时，用纯水作参比。(2)试样无色，试剂、显色剂有色，采用不加试样的空白溶液作参比。（试剂空白）(3)试样有吸收，而显色剂等无色，可采用不加显色剂的试样为参比。（试样空白）(4)均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色后再加显色剂等作为参比。(褪色空白),46,原理：朗伯比尔定律（A=bc）,方法：,（1）标准曲线法或工作曲线法,（2）比较法,溶液浓度的测定,47,先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图。,1）、工作曲线法,同条件下测未知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度。,48,