【生物工程下游技术】第八章-反胶团萃取VIP

微胶团：水溶液中表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”,水,非极性的“核”,极性“头”,非极性“尾”,反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”,非极性有机溶剂,极性“头”,极性的“核”,非极性“尾”,反微团内溶解的水称为微水相或水池,第八章、反胶团萃取,一、概述反胶团(ReversedMicelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。,反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性。,反胶团萃取的优点,(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便；(3)能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题；(4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；(5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。,二、反胶团的形成,1、反胶团的构造：在胶体化学中我们知道，如向水溶液中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定数值时，表面活性剂就会在水相中形成胶体或微胶团，它是表面活性剂的聚集体。其亲水性的极性端向外指向水溶液，疏水性的非极性“尾”向内相互聚集在一起。当向非极性溶剂中加入表面活性剂，并使其浓度超过一定数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与在水相中不同的是，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为反胶团或反向胶团。,构成反胶团的表面活性剂种类：阴离子表面活性剂AOT阳离子表面活性剂季铵盐非极性有机溶剂：环己烷，庚烷，辛烷等,分离蛋白质时，使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT。,2、反胶团的物理化学特性及制备,（1）反胶团的物理化学特性反胶团的临界胶团浓度表面活性剂在非极性有机溶剂中能形成反胶团的最小浓度反胶团含水率WW=C水/C表W越大，反胶团的半径越大,（2）反胶团的制备,注入法,相转移法,溶解法,三、生理活性物质的分离农缩,1、反胶团萃取原理,蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层,同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形,接着两界面形成含有蛋白质的反胶团,然后扩散到有机相中,从而实现了蛋白质的萃取。(可能机理）改变水相条件(如pH值、离子种类或离子强度),又可使蛋白质从有机相中返回到水相中,实现反萃取过程。,2、蛋白质的溶解,a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；b、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触；c、pro吸附于反胶团内壁；d、pro疏水区与几个反胶团的疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。,3、反胶团萃取1）分离场-分离物质的相互作用,溶解推动力静电作用：理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中左图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当pHpI,即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。,空间相互作用A.盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降。,B.在各pro的pI处(排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃取实验研究表明:随着M增大,pro的分配系数(m,溶解率)下降。表明随M增大,空间排阻作用增大,pro的溶解率降低.疏水性相互作用aa的疏水性各不相同,研究表明,aa或肽的m随aa疏水性的增大而增大。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数.疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解。,所以可以根据pro间M的差别选择性对pro进行萃取分离。,2）反胶束萃取的影响因素,水相的pH值盐离子的种类和浓度温度蛋白质的分子量和浓度表面活性剂,水相的pH值pH对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表面电荷上。在pH小于蛋白质的等电点(PI)时,蛋白质表面带正电荷;大于等电点时,蛋白质带负电荷。AOT是一种阴离子型表面活性剂,它所形成的反胶团的内表面带负电荷。当水溶液的pH小于蛋白质的等电点时,两表面异电荷的吸引力使蛋白质的萃取率接近100%。当pH大于PI时,溶菌酶萃取率急剧下降,直到接近于零。,盐离子的种类,盐浓度,盐浓度,W0,S而蛋白质浓度低时,萃取率较高。,表面活性剂表面活性剂的类型目前最常用的反胶团或微乳液是AOT/异辛烷体系。一是AOT形成的反胶团较大,有利于蛋白质的萃取;二是AOT形成反胶团时不需加助表面活性剂。表面活性剂的浓度当其它条件一定时,表面活性剂浓度也存在某临界值。小于此临界值时,增大表面活性剂的浓度可提高蛋白质的萃取率,大于临界值时,则无明显影响,四、反胶团萃取的应用,分离蛋白质混合物；浓缩-淀粉酶；从发酵液中提取胞外酶；直接提取胞内酶；用于蛋白质复性。,案例一：通过三步分离操作分离了核糖核酸酶a、细胞色素c和溶菌酶。依据原理1依据原理2,通过调节水相pH值和KCl浓度来实现三种蛋白质的分离。在pH=9时，核糖核酸酶的溶解度很小，保留在水相而与其他两种蛋白质分离；相分离后得到的反胶团相（含细胞色素C和溶菌酶）与0.5mol/L的KCl水溶液接触后，细胞色素C被反萃取到水相，而溶菌酶留在反胶团相；含溶菌酶的反胶团与2.0mol/LKCl，pH值为11.5的水相接触后，将溶菌酶反萃至水相中。,案例二：使用二级混合-分离型萃取流程，用TO