体外培育牛黄-省中西医结合医院呼吸科

中西结合拓展视野国家一类新药体外培育牛黄,牟胜提纲,体外培育牛黄的概况体外培育牛黄药理药效学现代研究体外培育牛黄相关临床验证介绍体外培育牛黄的安全性研究小结,引子：牛黄印象？,牛黄是牛的胆结石，又名西黄、犀黄、丑宝。气香，味苦而后甘。是备受我国中医界推崇的一味传统名贵中药，是许多名贵中成药的君药。具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、解毒功能。多用于治疗高热神昏、惊厥抽搐、中风、痰迷、癫痫发狂、咽喉肿痛、口舌生疮、痈肿疔疮等疾病。,呼吸专科相关的常见中成药,牛黄蛇胆川贝液牛黄消炎丸猴枣牛黄散小儿牛黄清肺片常见的感冒药：如氨酚黄那敏（因为价格原因，大多含人工牛黄）,牛黄为牛科动物牛干燥的胆结石，历来被誉为比黄金更为贵重的珍贵药材，也是诸多珍贵中成药如“安宫牛黄丸”、“片仔癀”等的主要成分。长期以来，药源紧缺，难以满足临床用药的需要，大量牛黄依赖进口。为此，国家药品监督管理部门自1972年陆续批准了3个牛黄代用品。,人工牛黄,1972年,培植牛黄,1989年,体外培育牛黄,1997年,背景：从体外培育牛黄的研发谈起,牛黄代用品人工牛黄,人工牛黄是由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等制成，为黄色疏松的粉末，味苦、微甘。其胆红素含量限制为不少于0.63%，应用也远远没有天然牛黄广泛.其制作工艺简单，价格极低.现在国家已明文规定急救中成药品(42种)不得采用人工牛黄入药,并有意向在以后的发展中抛弃人工牛黄.,模拟体内结石形成的原理和生物化学过程，在可控条件下体外培育的牛胆红素钙结石。,体外培育牛黄：现代生物工程技术的杰作,天然牛黄、体外培育牛黄、人工牛黄外观,研发历程,体外培育牛黄是在中科院资深院士裘法祖教授指导下，由华中科技大学同济医学院蔡红娇教授耗尽30年心血，应用现代生物工程技术，采用仿生学的方法，用新鲜牛胆汁在牛体外模拟天然牛黄形成过程培育出的牛胆红素钙结石,体外培育牛黄形成机理,(配方)新鲜牛胆汁-生物牛胆汁-成石牛胆汁-胆汁核心-成品生物反应生化过程牛黄机(摇转)分层培育干燥调节pH体外培育牛黄技术应用胆红素钙结石形成的静电效应原理,将新鲜牛胆汁通过生物技术制成成石胆汁，在一定必备的条件下，加入生物成核触发物，发生生物、生化反应，使成石胆汁内蛋白氢键形成，部分蛋白凝固变性，形成核心，其活动中心吸引母液中胆红素钙盐颗粒等物质，向中心沉淀。以高分子有机物质对沉淀颗粒的架桥作用，即线型聚合物的功能对颗粒的吸附作用，层层沉附，逐渐增大，脱水，干燥。形成牛胆结石，即牛黄成品,体外培育牛黄-“源于天然,优于天然”,稳定性安全性、毒性,体黄和天然牛黄稳定性对比,天然牛黄的采集来源于每一头个体牛,其每颗牛黄的成分和含量差异比较大。而体外培育牛黄采用工业化生成水平,能够在高水平条件下控制牛黄的成分和含量的稳定性,从而在稳定性上优于天然牛黄.,薄层扫描图谱付立叶变换红外光谱图谱HPLC指纹图谱指纹图谱,图谱分析,指纹图谱研究结果,10批体外培育牛黄酸水提取液HPLC-MSTIC叠加图谱,指纹图谱研究结果,10批体外培育牛黄酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC叠加图谱,指纹图谱研究结果,10批体外培育牛黄二甲亚砜提取液HPLC叠加图谱,HPLC指纹图谱的比较研究,结论：1、体外培育牛黄与天然牛黄三个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的成分种类均基本一致，但含量有差异。2、10批体外培育牛黄三个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的HPLC指纹图谱有较好的一致性，说明体外培育牛黄的工艺是稳定的。,体外培育牛黄的质量标准为国家药品标准WS3-45（Z-051）-2003（Z）除增加了游离胆红素检查外，其它各项（性状、鉴别、检查、含量测定、功能与主治、用法与用量、注意、贮藏）均与中国药典2000版一部及2005版药典、2010版药典中牛黄（指天然牛黄）的质量标准完全一致。,安全性：质量标准对比分析,注明：体外培育牛黄中游离胆红素的含量远远低于天然牛黄，而大量游离胆红素将引发毒性反应。这说明体外培育牛黄的质量标准比天然牛黄更加严格。,二、体外培育牛黄药理药效学现代研究,1、有效成份分析：体外培育牛黄的有效成份的分析已达97.6%，而且质量标准稳定可控；主要成分包括四大类：胆红素胆酸、去氧胆酸类氨基酸、肽类无机盐类(微量元素类）,胆红素,体外培育牛黄中胆红素含量在35.0%以上。胆红素为血红蛋白代谢后的过氧化物,结合型胆红素在生理浓度下能够有效地清除过氧化物、自由基，是机体内重要的内源性抗氧化剂,有着特殊的治疗作用。胆红素通过清除氧自由基、单线态氧、炎性细胞分子、病毒等发挥其抗炎解毒作用。胆红素可显著抑制大肠埃希菌、肺炎球菌和金黄色葡萄球菌等典型致病菌的增殖，并能杀灭乙型脑炎病毒。另外还具有有中枢镇静、抗惊厥、解热、降压、抗癌和促红细胞再生等作用,效果显著。,胆酸、去氧胆酸类,胆酸含量在6.0%以上，去氧胆酸含量为5.0%-7.0%，另外还包括牛磺酸胆酸盐、甘氨酸胆酸盐等胆酸盐类。胆酸、去氧胆酸是体外培育牛黄中具有生物活性的有效成分。胆酸、去氧胆酸及其盐类具有显著的解热作用；去氧胆酸对四联球菌、金黄色葡萄球菌、奎氏双球菌、链球菌等具有明显的抑制作用。除此之处，胆酸、去氧胆酸还具有解痉、镇咳等药理活性。,氨基酸、肽类,体外培育牛黄含有牛磺酸等18种氨基酸，糖蛋白含量为1.8%-2.5%，此外，胆固醇含量为0.8%-3.0%，卵磷脂含量为1.75%-3.0%。牛磺酸具有镇痛、解热、镇静、抗惊厥、心肌保护、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗心衰、解毒、利胆、保肝、增强免疫作用等。,微量元素类,测定结果显示体外培育牛黄中还含有钙、铁、锌等21种微量元素，能增强动物机体内的抗氧化酶的活性和总抗氧化能力，阻断或清除自由基形成及其连锁反应，保持机体内产生和清除自由基的动态平衡，保护细胞完整性,（1）抗惊厥（2）镇静（3）解热（4）抗炎（5）抗菌（6）抗病毒（7）降压（8）护肝（9）抗肿瘤（10）耐缺氧、清除自由基和抗衰老作用,体外培育牛黄的主要药效,抗惊厥、镇静,体外培育牛黄对安钠咖致小鼠惊厥，吗啡致小鼠竖尾反应有明显的对抗作用，而与戊巴比妥钠合用则有协同催眠作用。人工牛黄粉则无上述中枢抑制作用,降压作用,体外培育牛黄能明显降低大鼠的血压，但不影响其心率和心电图,解热作用,体外培育牛黄对酵母致大鼠发热和伤寒副伤寒三联疫苗致家兔发热均有明显抑制作用,抗炎作用,体外培育牛黄对急性炎症的渗出和白细胞的趋化均有抑制作用体外培育牛黄对急性炎症的渗出和慢性炎症的增生均有显著抑制作用，其抗炎作用强度与等量天然牛黄相似，以200-800mg/kg灌胃给予动物5-7d，可显著抑制小鼠巴豆油性耳廓水肿，大鼠角叉菜胶性足趾肿胀，大鼠巴豆油性肉芽囊肿的渗出和组织增生，抑制白细胞游走反应，对抗前列腺素E2所致毛细血管渗透性增加，但不能影响肾上腺中维生素C的含量，提示其抗炎作用不是通过垂体-肾上腺皮质系统，而是通过抑制炎症组织中致炎物前列腺素E2的生成而发挥作用的。,抗菌作用,体外培育牛黄能显著降低感染金黄色葡萄球菌小鼠的死亡率,抗氧化、抗衰老作用,体外培育牛黄能显著提高脑、心、肝组织及血清中SOD、GSH-px、GSH活性，提高总抗氧化能力。明显降低脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量。体外培育牛黄含有铜、锌、锰、硒等多种微量元素，能增强老幼化动物机体内的抗氧化酶的活性和总抗氧化能力，阻断或清除自由基形成及其连锁反应。保持机体内产生和清除自由基的动态平衡，保护细胞完整性，发挥抗衰老作用。,护肝,通过血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染家免构建肝纤维化模型，应用体外培育牛黄复合制剂进行干预治疗，采用Masson染色法及图像分析仪测定肝组织胶原纤维的含量，采用Westemblot及免疫组织化学方法检测家兔门静脉壁ERK1/2及C-fos的表达。结果表明：模型组家兔肝组织胶原纤维含量、ERK1/2活性和C-fos平均染色体指数较正常对照组明显增加，药物组肝脏上述指标比模型组明显降低，差异具有显著性（P0.05），提示体外培育牛黄可以明显减轻血吸虫病肝纤维化程度，可能通过影响ERK1/2/C-fos信号途径来干预血吸虫病门静脉高压性血管病变的形成，对肝纤维具有改善和治疗作用。,抗肿瘤,采用单层培养法培养人肝母细胞瘤HepG2细胞，用不同剂量体外培育牛黄作用于HepG2细胞，以荧光显微镜、透射电镜在不同时间点观察细胞形态的改变及其凋亡，用流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡率。结果表明，100-800g/mL体外培育牛黄作用于HepG2细胞48h后，出现细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征性形态学改变；流式细胞直方图上可见亚二倍体峰，其不同作用时段的细胞凋亡率均显著高于空白对照组。结果显示体外培育牛黄能诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡，具有抗癌细胞作用。研究表明，肿瘤的发生和发展不仅与细胞的分化异常及增殖过度有关，而目与细胞凋亡的减少密切相关，而一旦细胞增殖与凋亡失控，则可导致肿瘤的发生。体外培育牛黄作用于人肝母细胞瘤HepG2细胞后，发现其能诱导癌细胞凋亡，并可能还有抑制癌细胞生长的作用。,从中医药学的角度看：体外培育牛黄六大功效,豁痰开窍清心凉肝息风解毒,豁痰,消除炎症，使痰化解，保护呼吸系统功能胆酸具有显著的祛痰作用。胆酸和去氧胆酸还有镇咳作用。中医小术语：祛痰，化痰，豁痰,解毒,与其具有的抗病毒、抗癌、抑菌、抗炎、抗真菌作用有关系。主要物质基础：胆红素、胆酸,开窍,打通神经系统和循环系统经络，恢复器官功能与抗惊厥、抽搐、癫痫作用有关。胆酸、去氧胆酸抗惊厥,清心,使处于昏迷状态的人神智清醒，与其具有镇静、强心作用有关。胆酸、牛磺酸、去氧胆酸镇静牛磺酸抗心衰胆酸及其钙盐对心脏有兴奋作用,凉肝,清除肝火，解除头晕、目赤、易怒等。与其具有解热、降温等作用有关系牛磺酸、胆酸、胆红素、去氧胆酸解热胆酸、去氧胆酸、牛磺酸降温,息风,使癫痫、神经失常的病症得以消除。与其具有的镇静、抗惊厥、抗癫痫等中枢抑制作用有密切关系。胆酸、去氧胆酸、牛磺酸镇静胆酸、去氧胆酸抗惊厥,体外培育牛黄具有清热解毒、豁痰开窍、息风凉肝等作用，药理实验证明可提高巨噬细胞吞噬功能，在免疫、抗炎方面起到重要作用。体外培育牛黄还有显著的祛痰作用，同时胆酸与去氧胆酸有显著镇咳作用，因此含有牛黄的多种制剂常用于治疗上呼吸道感染。体外培育牛黄除了具有抗惊厥、镇静、解热作用外，还有耐缺氧、清除自由基，具有显著的保护缺血缺氧细胞功能的作用。,小结,体外培育牛黄缺血缺氧细胞的保护作用,体外培育牛黄耐缺氧、清除自由基实验,1.1.1常压耐缺氧实验：实验组小鼠18-20g，用ICCB800-600mg/Kg，ig给药5天后，将小鼠放入标定250ml广口瓶内（每瓶放钠石灰5g），自封瓶口天始，直至小鼠呼吸停止，计算存活时间。设阴性对照组ig给药0.2ml/只和心得安对照组，方法相同。,1.1.2缺血缺氧小鼠实验：小鼠连续igICCB800mg/Kg5天后，放入250ml广口瓶内（每瓶放钠石灰5g），自封瓶口时起计时，10分钟后取出小鼠，并剪尾放血0.5ml(3%)。连续ig给药5天后处死，采血、脑、心、肝脏组织匀浆作SOD活性和MDA含量测定。,实验结果,ICCB耐缺氧清除自由基实验结果1,ICCB对小鼠常压缺氧耐受力的影响,体外培育牛黄800-1600mg/kg，均能显著提高缺氧小鼠的耐受力，明显延长缺氧小鼠的生存时间，与对照组比较有显著差异。,*P0.001,说明,ICCB耐缺氧清除自由基实验结果2,ICCB对缺血缺氧小鼠的血清及脑、心、肝组织匀浆SOD活性的影响。,*P0.005*P0.01,体外培育牛黄组缺氧小鼠血清及脑、肝组织的SOD活性均显著高于对照组。,说明,ICCB耐缺氧清除自由基实验结果3,ICCB对缺血缺氧小鼠的血清及脑、心、肝组织匀浆MDA含量的影响。,*P0.05*P0.01*P0.001,体外培育牛黄缺氧小鼠的心、肝、脑组织和血清MDA含量均低于对照组。特别是心脏组织匀浆MDA含量与对照组比较有非常显著差异。,说明,ICCB耐缺氧清除自由基实验结果4,ICCB对缺血缺氧小鼠脑组织的超微病理的改变。,体外培育牛黄治疗组缺血缺氧小鼠脑组织超微病理改变很轻微，而对照组则很严重。,说明,结果讨论：体外培育牛黄具有保护缺血缺氧细胞的作用，作用机制是其具有提高机体耐缺氧能力和抗氧化酶活性，提高机体清除自由基能力，减轻脂质过氧化作用对缺血缺氧细胞的损害，调节神经递质，保护或恢复神经通路，从而达到保护细胞功能的作用。,小插曲：国食药监注200421号,对于国家药品标准处方中含牛黄的临床急重病症用药品种，和国家药品监督管理部门批准的含牛黄的新药，可以将处方中的牛黄以培植牛黄、体外培育牛黄等量投料使用，但不得以人工牛黄替代。,SFDA规定必须使用牛黄或者体外培育牛黄的42个临床急重病症用药品种名单（2004）,一）I、II、III期临床试验综述受试药物：单味体外培育牛黄及其安宫牛黄丸、片仔癀。对照药物：单味天然牛黄及其安宫牛黄丸、片仔癀。治疗疾病：中风、乙脑、急性咽炎、牙周炎、疖肿。疗效：疗效良好，与优质天然牛黄无统计学差异。,第四部分：体外培育牛黄临床应用经验介绍,临床研究医院：华中科技大学同济医学院附属同济医院武汉大学中南医院湖北中医学院附属医院广州中医药大学附属第一、第二医院临床药理基地福建中医学院附属人民医院,福建省中医研究院,II、III期临床试验共1852例治疗结果：,注：以上治疗组均为体外培育牛黄，对照组均为天然牛黄,相关临床文献简介,牛黄蛇胆川贝滴丸对COPD急性发作期的血气影响牛黄蛇