酶组织化学概论52636.ppt

酶组织化学概论,酶是一种具有催化活性的特殊蛋白质。人体的各种机能活动都与酶的活性有密切关系。国际生物化学酶学委员会已登记的酶有2200多种。但当前组织化学技术所能显示的酶仅200多种。,酶组织化学是用组织化学的方法证明酶的存在，它的基础是组织化学，目的在于阐明组织细胞内的化学反应、功能及其生物学意义。,一、酶的分类1.氧化还原酶是催化氧化还原反应的酶。包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加单氧酶。如苹果酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶与羟化酶或混合功能氧化酶。,2.转移酶即催化功能基团转移的酶。此大类可根据底物中被转移的基团性质分为8个亚类。其中第6亚类为转移含氮基基团的酶，如天门冬酸转移酶。3.水解酶即催化水解反应的酶，称为水解酶。水解酶又可根据其与水解反应有关的键的类型进一步分为亚酶类，如酯酶、糖酶和肽酶。,4.裂解酶又称裂合酶。促进一种化合物分成两种化合物，或由两种化合物合成一种化合物的酶类。它可使底物移去基团，如H20、C02，并出现双键。此类酶的亚类比较多，一般表示分裂的基团，如其中第1亚类为裂解C-C基团的酶，如草酰乙酸脱羧酶；第2亚类是裂解C-O基团的酶，如脱羧酶等。,5.异构酶催化同分异构体的相互转化。磷酸葡萄糖异构酶，磷酸丙糖异构酶等。6.合成酶（又称连接酶）系指能将两种物质合成为一种物质，并必须与ATP分解相偶联的酶。,二、光镜酶组织化学证明法1金属-金属盐法金属盐法一般是指金、银、铜、铁、铝、钴等金属。金属、金属盐及其化合物都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的分解产物和金属多半可以结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再显现出酶反应的部位，就可以证明某种酶的存在。,酶作用于底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶的反应局部，然后使其显色。其反应式如下：Pb2+(NH4)2SR-PO4Na2+H2OROH+PbHPO4PbS酶反应显色,这种方法在底物溶液中的H+浓度为中胜或弱酸性，常常可利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此，本法常被应用于酸性磷酸酶和在中性附近起作用的磷酸酯酶类。通常称本法为硫化铅法。,证明碱性磷酸酶时，通过形成可见的黑色硫化钴，称为硫化钴法。Ca2+R-PO4Na2+H2OROH+CaHPO4酶反应Co2+（NH4)2SCoHPO4CoS金属置换显色,用这些金属盐法能够证明的酶多半是水解酶。其中有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、胆碱酯酶等。此外，根据磷酸酶的理论，利用组织化学的鉴别法能证明的酶还有磷酰胺酶、5-核苷酸酶、ATP酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。,2偶联偶氮色素法偶联偶氮色素法，此法又称偶氮色素法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。,在这种方法中，最常用的分解产物是茶酚系列的化合物，如2-萘酚、1-萘酚、萘酚AS、萘酚AS衍生物等。但这些化合物本身也有一定的溶解性，因而其分解产物有扩散的缺点。基于重氮盐种类不同，其偶氮颜色也各有差异，可显示出蓝色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色等各种颜色。,根据偶联的时间不同，将偶氮色素法分为两种。1）同时偶联法同时偶联法是在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。2）后偶联法后偶联法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。,目前，可用这种方法证明的酶有：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、-葡苷酸酶、-半乳糖苷酶、-葡糖苷酶、N-乙酰基-氨基葡糖酶、氨基肽酶、硫酸酯酶等等。,3.色素形成法（1）四唑盐法四唑盐法是指含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，形成红色或蓝色的甲（formazan）或二甲（diformazan）色素。该法主要证明各种脱氢酶。,（2）靛酚蓝法靛酚蓝法用于检测氧化酶的方法，把二甲基-对-苯二胺和-萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此二者发生结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。,4.底物薄膜法底物薄膜法是把酶底物在载物片上涂成膜，然后再将含酶的组织切片贴附其上，给以条件让酶发生反应，使底物分解。接着剥离贴附的切片，对膜进行特殊染色，只有底物被分解的部位不着色，而未被分解的部位被染色，故未着色部位就是酶的定位。,三、电镜酶组织化学证明法1氧化还原酶（1）四唑盐法四唑盐是水溶性的，在水溶液中几乎无色，还原后则难溶于水和脂质，变成有色的高电子密度的甲。现在最常用的四唑盐有NBT和TNBT等。,（2）高铁氰化物还原法本法是金属盐法的一种，高铁氰化物作为人工受氢体而被使用。高铁氰化物接受由酶作用而游离出来的氢，从而变成亚铁氰化物，此物质不溶于水，并以电子密度高的亚铁氰化铜的形式在酶活性部位被捕捉而沉着。,琥珀酸延胡索酸琥珀酸脱氢酶Fe(CN)63-Fe(CN)64-高铁氰化物亚铁氰化物Cu2+Cu2Fe(CN)6XH2O亚铁氰化物,（3）二氨基联苯胺法二氨基联苯胺法（diaminobenzidinemethod，DAB）法主要用在直接证明细胞色素氧化酶、过氧化物酶（内源性）、过氧化氢酶活性检测。DAB还用于形成嗜锇性多聚体。,2.水解酶（1）胆碱酯酶活性检查法1）乙硫羧酸法根据使用的捕捉金属种类的不同可有铅乙硫羟酸法等，在酶的作用下，游离的硫化氢与铅反应，形成硫化铅沉着于酶的活性部位。酯酶Pb(NO3)2CH3COSHCH3COOH+H2SPbS,2）嗜锇性硫酯法是以嗜锇性硫酯作为底物，用坚牢蓝BBN做偶联剂的方法。,四、对照实验1.抑制剂对照用酶活性的抑制剂确认酶活性受到抑制。cATP腺苷+PiATPPPiADP+Pi,环化酶,ATP酶,四氧嘧啶,磷酸二酯酶,茶碱,特异性底物：5-腺苷酰-亚氨二磷酸cATP+PNP（亚氨二磷酸）ATP-PNP无水解作用,环化酶,ATP酶,2.去底物对照用去底物的无底物孵育液