蚕豆病鉴定的实验设计

年级、专业、班级： 2010级临床三、四大班实验时间： 2012年4月18日实验室：第二实验室组：第四组成员：梁婧、和珍、李艳、张玲艺、解汐卓、成春梅、吴皓、杨紫燕、王骅、张庆昆报告员：吴皓、患儿、男、3岁，伴颜色苍白和血尿入院1 d 1天前吃完新鲜蚕豆后，今天恶心、呕吐、排尿呈酱油般颜色，面色苍白。 据监护人说，患者的姐姐也发生了同样的事情。 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神志清楚，面色苍白，皮肤巩膜黄染，体型较同龄人瘦。 心、肺无异常，肝、脾未触及，双肾区无叩痛，神经系统检查无异常。 实验室检查：红细胞1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，胆红素13.7mol/L，胆红素71.8mol/L，尿蛋白( )、潜血( )、尿胆红素(-)、尿胆红素原( )、尿镜下未见红细胞。 病例，1，根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是什么病2，设计实验，进一步明确诊断。 从生化代谢角度阐述患儿的临床表现和实验室检查结果。 4、探讨该病发生的分子基础，用什么技术可以检测出什么目标基因？ 5、患者体型瘦是否与此病有关，为什么首先要判断患儿是什么病？红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD )缺乏症(蚕豆病)，性别：男性年龄： 3岁主要症状：体温38，颜色苍白，血尿1天，皮肤和巩膜黄染，恶心，呕吐诱因： 1天前吃新鲜蚕豆既往史：患者姐姐也有同样的经历，概念： G6PD缺乏症为遗传性溶血性疾病。 发病率有地方、民族差异。 发病机制： G6PD、NADPH H 、GSH、红细胞抗氧化能力、溶血、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD )缺乏症、正常红细胞、溶血性贫血红细胞、左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿(黄疸)、左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿(黄疸)、正常红细胞、 溶血性贫血红细胞左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿(黄疸)，正常红细胞，溶血性贫血红细胞，左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿(黄疸)，分类：伯氨喹啉型药物性溶血性贫血新生儿黄疸病感染性溶血先天性非球形细胞溶血性贫血(CNSHA )，红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD ) 缺乏症蚕豆病是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD )缺乏引起的疾病，遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD )缺陷表现为吃新鲜蚕豆后突发的急性血管内溶血。红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD )缺乏症，主要临床表现为：早期出现恶寒、微热、眩晕、乏力、食欲缺乏、腹痛、黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，随后体温升高、乏力加重，可持续3 d。 出现溶血性贫血，伴呕吐、腹泻、腹痛加重，肝脏肿胀，肝功能异常，约50%患者脾脏肿胀。 重症病例可见昏迷、痉挛、急性肾功能衰竭，急救不及时可在12天内死亡。，遗传方式： G6PD缺乏症是x链不完全性遗传，母亲： XX父亲： XY，子女： XXXXxxXYXY，儿子生病，女儿： xx父亲： xy，子女： xxxxxyxy，儿子正常，女儿50%，母亲： xx父亲： xy，子女： xxxxxxxyxy，女儿50%机会生病， 儿子50%机会携带该基因X-病原基因，患该病男女比例约=7:1，从生化代谢说明患儿的临床表现和实验室检查结果，主要临床表现为：1.血尿、酱油色尿、颜色苍白2 .皮肤和巩膜黄染3 .体温上升4 .呼吸快，1 .血尿、酱油色尿、颜色苍白、G6PD GSSG (氧化型谷胱甘肽)、NADP、NADP、a、AH2、GSH (还原型谷胱甘肽)、GSH的主要作用是保护红细胞内的含硫氢基(-SH )血红蛋白、酶蛋白、膜蛋白的完整性免受氧化与谷胱甘肽过氧化酶一起将H2O2转化为H2O NADPH H 红细胞抗氧化能力GSH红细胞膜破裂；溶血性贫血(颜色苍白)游离Hb肾吸收阈值；血红蛋白尿/含铁蛋白尿；2 .皮肤及巩膜黄染；机制：溶血性黄疸；3 .体温上升；机制：红细胞破裂；血红蛋白暴露， 免疫系统攻击(单核-吞噬细胞系)、体温上升， 4 .具有呼吸快、溶血性贫血o2承载能力的Hb含量降低机体为O2呼吸快、红细胞为1.981012/L(6.0-7.0)1012血红蛋白为53g/L(170-200)g/L血清总胆红素为85.5mol/L(3.4-17.1)mol/L 从L结合胆红素71.8mol/L尿蛋白( )、潜血( )、尿胆红素(-)、尿胆红素原( )、生化代谢说明患儿的临床表现和实验室检查结果，实验室检查结果为正常值，2， 设计、贫血、黄疸、有无遗传史、有无诱因(吃蚕豆、吃药、感染)、体征：脾肿大、黄疸、血清学检查、HA病因检查、G6PD筛查试验、G6PD确诊试验、Hb、网状红细胞、间接胆红素尿胆原游离HB结合珠蛋白，怀疑其他HA 相应的病因检查结果正常，进行G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定，G6PD基因分析，其他筛选试验，高速血红蛋白还原试验，初诊或确诊G6PD缺陷症，确诊贫乏(血管内溶血)，确诊G6PD，1项或2项，进行1项， 高速血红蛋白还原试验G6PD荧光斑点试验进行红细胞G6PD活性测定，筛选试验，确诊试验，确诊试验，另一方面，高速铁路血红蛋白还原试验，实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，将红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高速铁路血红蛋白(MHb ) 在这一过程中，甲氧血红蛋白还原酶作为供氢体不仅需要亚甲基蓝，而且还需要G6PD参与磷酸戊糖以NADPH为辅酶形成。 因此，G6PD缺陷症患者的MHb还原率降低(分光光度技术)。铁血红蛋白高速血红蛋白，亚硝酸钠，高速血红蛋白还原酶NADPH (辅酶)亚甲基蓝(氢供体)，实验反应方向，实验原理， 主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、0.4mmol/L亚甲基蓝溶液、0.28mol/L葡萄糖溶液、混合液()、生理盐水、抗凝剂仪表：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3根、高铁血红蛋白单白还原实验、实验流程、 取静脉血1.8mL取抗凝管，混合抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂葡萄糖20mg )，调整离心沉淀1000r/min15min，血细胞：血浆=11，混合调整后全血(备用)、1ml0.18mol/L亚硫酸钠1 ml 0.0 l -葡萄糖溶液混合混合试剂(备用)1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液、高速血红蛋白还原实验、实验工艺、试管取3根，附上a、b、s，按照下表添加试剂，高速血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01/生理盐水/ml/0 在l亚硝酸钠-/0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL调整全血/mL0.10.10.1左右摇动1520次，放入37的水浴箱中静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10.00ml，试剂ABS，高速血红蛋白单白还原实验， b管为空白管，在波长635nm下测定“a”管和“s”管的吸光度，实验工艺为高速血红蛋白还原率式： MHb%=(1-A/S)100%、高速血红蛋白还原实验、实验工艺注意事项、实验1 (高速血红蛋白还原实验):1、血细胞比容积比过低、高速血红蛋白还原血细胞比容调整为0.35-0.402，细菌污染产生亚硝酸盐变为假阳性，试管等无菌3、不稳定Hb、高脂血症等出现假阳性的结果，因此应在2h以内送检查4，标本无凝血或溶血，因此应使用抗凝血管5，在标本内适当加入葡萄糖，避免全血不足，2， G6PD荧光斑点试验实验原理：葡萄糖-6-磷酸(G6P )在G6PD形成6-磷酸葡萄糖(6PGA )的同时，将NADP转换为NADPH，后者在340nm波长的紫外线照射下产生荧光(反应原理如下图)。 因此，将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混合后，每0分钟、5分钟、10分钟分别在滤纸上采集1滴血，通过观察滤纸上出现荧光的时间，可以得到G6PD活性、NADPNADPH、G6P6PGA、G6PD、实验原理、试剂：反应液： G-6-P 二份皂甙， 3份磷酸缓冲液和3份蒸馏水的混合仪器：取长波紫外灯、滤纸、水浴箱、G6PD荧光斑点试验、实验流程、G6PD荧光斑点试验、试管，加入全血100l的反应液使其均匀，滴入滤纸中(第一斑点)作为对照，将上液在37水浴中滴入10min，滴入滤纸中(第二斑点) 取实验组，晾干后，在长波紫外灯下(365nm )根据观察结果、计时、结果进行相应诊断，实验G6PD荧光斑点试验):1、检查的第一点作为实验对照，采用无荧光或出现弱荧光的2、每次正常的标本(已知G-6-PD正常)作为阴性对照有可能选择G-6-PD不足者的标本作为阳性对照3时，应该像贫血那样增大采血量，或者应该用红细胞悬浊液进行检查，为了提高敏感性，可以在反应液中加入1份8.0mmol/LGSSG，实验过程的注意事项，3，红细胞G6PD活性测定，实验原理：基本原理为G6PD荧光斑点实验不同点在于，采用紫外光分光光度法定量酶活性，即，每隔1分钟在340nm波长下测定培养液中的NADPH吸光度(6次测定)，求出每隔1分钟的吸光度增加的平均值，在单位时间内生成NADPH，这取决于所使用的试剂和系统。方法：WHO推荐的Zinkham NBT定量法等实验原理，试剂：生理盐水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris缓冲液(pH7.5 )、0.63mol/L氯化镁溶液、33mmol/LG-6-P液，仪器：紫外分光光度计箱、离心分离机实验工艺，用抗凝固2ml生理盐水洗涤红细胞3次(1500r/min离心10min )，除去上清和乳白层(白细胞和血小板)等体积生理盐水红细胞悬浊液、红细胞悬浊液0.05ml溶血素0.5ml，混合，10min放置溶血液测定Hb浓度，比色(参照下表)， 红细胞G6PD活性测定G-6-PD活性测定的操作表(Zinkham法)、试管对照管测定管、NADP液(ml)0.10.1Tris液(ml)0.10.1氯化镁液(ml)0.10.1蒸馏水(ml)0.680.58G6P液(ml)0.137预热血液(l)2020 红细胞G6PD活性测定，立即在340nm下测定吸光度，用对照管调整零，在37下恒温，每分钟观察一次，记录吸光度的变化，实验流程，计算公式： G-6-PD活性(u/ghb )=a/min 1000/6.221020/20hb (GL-1 )a/min :实验工艺、红细胞G6PD活性测定、实验三(红细胞G6PD活性测定):1、急性溶血期后23个月复查或复查G6PD活性2，阴性对照和阳性对照(影响因素多) 3、离心沉降后取基底红细胞测定G6PD活性，实验工艺注意事项、结果分析方法、一、 高速血红蛋白还原试验：正常值： MHb还原率=75%脐带血=77%临床诊断：纯合子和半合子(XY )患者： MHb还原率30%脐带血40%杂合子患者： MHb还原率31%74%脐带血41%76%，二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验正常者：0min斑点无荧光， 5-10min出现10min荧光最强临床诊断：轻度缺陷者：0-10min荧光弱或中度缺陷者： 10-30min荧光严重缺陷者： 30min以内未出现荧光，结果分析方法，三、 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定G6PD缺陷者：可诊断G6PD活性比正常平均值低40%以上的WHO推荐的zink AAM (12.012.09 ) iu/ghb (37) icsh推荐的Glock和McLoan法(8. 34-1.59 ) iu/ghb NBT定量法(13.130.0)NBT单位Chapman和Dern法(2.87.31)IU/gHb(25)， 结果分析方法G6PD缺乏症的诊断要点，临床符合上述任一类型，可诊断1项筛选试验活性严重缺乏值1项筛选试验活性中间缺乏值， 明确的家族史2项筛选试验活性的中间性缺乏值比1项G6PD活性的定量测定的平均值低40%以上、G6PD基因分析、探针技术放射性核素生物素(DIG探针)荧光染料印相技术、DNA印相蛋白的印相分析、 实验原理： inisitionitybriditionizitionhistochemistryishh )是一种分子杂交，是一种利用标记探针与组织细胞中待测核酸杂交，应用与标记物相关的检测系统，在核酸原始位置对其进行检测的检测技术。原位杂交技术、原位杂交技术(DIG探针)主要试剂：二甲苯、各级浓度醇、蒸馏水、0.01mol/LPBS、3%过氧化氢-甲醇溶液、冲孔液