选修一血红蛋白的提取和分离PPT教学课件.ppt

课程标准尝试提取和分离蛋白质。 课标解读1 .了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物高分子技术的基本原理。 2 .掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。 1、1 .凝胶色谱(1)的概念也称为分离蛋白质的有效方法。 (2)由原理构成的凝胶，内部有很多贯通。 血红蛋白提取和分离的基本原理、分配色谱法、相对分子质量大小、多孔球体、通道、2、不同蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部通道、行程、移动速度，而相对分子质量的蛋白质进入凝胶内部通道相对分子质量、小、长、慢、大、凝胶外部、短、快、分离、3、2 .缓冲溶液(1)在一定范围内起作用，抵抗外部溶液对pH的影响，维持pH值。 (2)调制可以将12种溶解于水中进行调制，得到在不同pH范围内使用的缓冲液。 酸和碱，调节几乎没有变化的缓冲剂、缓冲剂的比例，4，3 .电泳(1)的概念是指在电场作用下发生的过程。 (2)原理上，多肽、核酸等生物高分子的解离性基团在一定的条件下，或者通过电场，这些带电分子向电极移动。 与带电粒子、移动、pH、正电、负电、以及带电的电荷相反，5、(3)作用电泳是利用分离样品中各种分子的不同和分子本身的不同，使带电分子产生不同，在样品中实现的。 (4)方法中常用的电泳方法有和。 测定蛋白质的分子量时通常使用。 带电性质、大小、形状、移动速度、各种分子的分离、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、6，思维活化1凝胶色谱和电泳法在实现分子分离原理方面有什么不同？ 凝胶色谱分离根据分子质量的大小，利用凝胶柱优先洗脱大分子，分离小分子。 用电泳法分离分子，根据各种分子的带电特性的不同和分子自身的大小、形状，使带电分子产生不同的移动速度，实现用电场分离各种分子。 7、蛋白质的分离可以根据蛋白质各种特性的不同，如分子的形状和大小、带电性质和量、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等来分离不同种类的蛋白质。8、(1)凝胶色谱、9、(2)电泳法的意思：带电粒子在电场的作用下移动的过程。 原理：一些生物高分子具有可解离的基团，在一定的pH下带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子向与带电电荷相反的电极移动。 由于各种分子的带电特性的不同和分子自身的大小、形状的不同，移动速度也不同，实现了各种分子的分离。 常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质的相对分子质量，通常采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，该方法也用于蛋白质混合成分(亚基)的分离。 10，“坚固1”凝胶色谱分离蛋白质的原理依据为() a .蛋白质分子和凝胶的亲和力的大小b .蛋白质的相对分子质量的大小c .蛋白质带电的电荷量d .从蛋白质溶解度的大小来看，凝胶色谱中使用的凝胶实际上是几个微小的多孔质球体，在小球的内部有很多贯通通道， 对于分子质量小的蛋白质，容易进入凝胶内部的通道，在很长的路程中，移动速度慢，相对分子质量大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程短，移动速度快。 不同分子质量的蛋白质分子被分离。 答案b，11，1 .蛋白质的提取和分离一般分为4个阶段：和。2 .样品处理(1)通过红细胞的清洗采集血液样品，吸入血浆后进行清洗，再以低速短时间离心，重复3次清洗直至上清中没有黄色。 目的有利于下一步的分离纯化。 血红蛋白提取和分离的实验操作和评价，样品处理，粗分离，精制，纯度鉴定，低速短时间离心，生理盐水，杂质除去，12，(2)将血红蛋白释放洗涤的红细胞依次加入原来的血液体积，40%体积，在磁力搅拌器上搅拌10分钟，吸收红细胞，释放血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液，将搅拌的混合液转移到中间，以2000r/min的速度转移10min。 分离血红蛋白和其他杂质，便于下一步血红蛋白的纯化。 蒸馏水、甲苯、膨润、离心管、离心管、13、(4)透析是将1mL血红蛋白溶液放入透析袋中，放入300mL的物质，在量浓度为20mmol/L中(pH为7.0 )，透析12h (试样中的相对分子质量小的杂质除外)。 3 .凝胶色谱操作(1)凝胶柱的制作：材料的准备橡胶塞的加工安装。 (2)凝胶柱的装填。 (3)样品的。磷酸缓冲液、色谱柱、添加和洗脱、14、4 .操作(1)红细胞的清洗至关重要。 洗涤次数过少无法除去的离心速度和时间一起沉淀，无法得到分离效果。 (2)柱填充剂处理商品的凝胶在使用前必须直接放入其中使其膨胀，可以加速放入其中的湿润凝胶的膨胀。 洗涤次数、离心速度、离心时间、血浆蛋白质、过高、白细胞、洗脱液、沸腾水浴加热，15、(3)填充凝胶柱时不可存在。 由于扰乱洗脱液中的蛋白质，降低了分离效果。 (4)蛋白质的分离表明制备柱是成功的。 气泡、洗脱顺序、红带均匀移动，16，思维活化2透析的目的是什么？ 基于什么原理？透析的目的是去除血红蛋白溶液中相对分子质量小的蛋白质，透析的依据原理是半透膜只允许小分子透过，大分子不允许透过。 17、1 .样品处理(1)清洗红细胞目的：去除杂蛋白。 方法a .血样采集b .低速短时离心c .血浆吸引d .盐水清洗e .低速离心d、e重复3次步骤。 18，(2)血红蛋白红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液使混合液离心时，试管中溶液的层显着(从上向下):第1层：无色透明的甲苯层； 第2层：脂溶性物质沉淀层白色薄层固体； 第3层：血红蛋白水溶液红色透明液体； 第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。 用滤纸过滤液体，除去脂溶性沉淀层，在分液漏斗中静置一段时间后，分离下层的红色透明液体。19、的目的：通过离心分离血红蛋白和其他杂质，使下一步血红蛋白的纯化变得容易。 (4)透析原理：透析袋使小分子自由出入，大分子留在袋中。 过程：将1mL血红蛋白溶液放入提取袋中，将提取袋放入装有300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(ph7.0)，透析12h。 目的： a .去除样品中相对分子质量小的杂质的b .样品更换用缓冲液。20、2 .凝胶色谱操作、21、3 .纯度检定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳需要判定纯化蛋白质是否达到要求，进行蛋白质纯度的检定。 鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。22、4 .结果的分析和评价，23、24，特别是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，很多蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS )以重量比结合在一起，蛋白质分子所具有的负电荷超过天然蛋白质分子的负电荷由于消除了不同蛋白质分子的电荷效应，蛋白质分子的相对迁移率的大小完全依赖于相对分子质量的高低，因此可以从已知相对分子质量的标准蛋白质的对数和相对迁移率的标准曲线求出供试品的相对分子质量。 在25，“坚牢2”血红蛋白的提取过程中，继续用磷酸缓冲液处理的目的是() a .抗血红蛋白氧化的b .血红蛋白是两性物质，酸和c .磷酸缓冲液使血红蛋白的提取过程d .血红蛋白处于稳定的pH范围，维持其结构和功能分析，利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，分离观察(红色)和研究(活性) 在下图中，分子质量不同的蛋白质在凝胶中移动的过程是() 血红蛋白的提取和分离的基本原理，27，思维图：深度分析正题考察凝胶色谱的原理。 分子筛效应表明，相对分子质量大的蛋白质分子通过的程度短，移动速度快，相对分子质量小的蛋白质分子通过的程度长，移动速度慢。 因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量最小的分子最后流出，因此选择了b。 答案b，28，特别是注意血红蛋白的分离方法和相关原理的比较：29，【例2】下图是使用除去了DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，以下的记述不正确。 血红蛋白的提取和分离的实验操作，30，a .首先，图甲装置处理滤液的目的在于，相对分子量小的杂质b .图乙装置的试管采集的液体中最初出现的是相对分子量小的蛋白质c .图乙装置分离血红蛋白时，直到红色的蛋白质接近柱的下端为止， 试管取流出液，每管取5mL，d .图丙装置电泳法分离纯化血红蛋白的原理是血红蛋白具有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动，31，思维图：深度分析是以图甲装置处理滤液，去除分子质量相对较小的杂质为目的。 图乙装置展示了凝胶色谱法分离蛋白质的过程。 蛋白质的相对分子量大，排出凝胶粒子外，迅速通过粒子间。 从b，32，“摘要综合”蛋白质的提取和分离，33，横栏思考问题凝胶色谱分离原理，为什么凝胶的填充密集均匀？答案凝胶实际上是一些小多孔球体，小球体内部有很多穿透通道。 相对分子质量大的蛋白质不能进入凝胶粒子内部，只能在粒子间分布，通过的程度短，移动速度快的相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内的通道，通过的距离长，移动速度慢。 34、因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，分离出各种相对分子质量不同的分子。 凝胶填充不充分、均匀时，柱内形成无效空隙，本应侵入凝胶内部的样品分子通过该空隙，扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱顺序，影响分离效果。 35、练习1 .分析本问题，考察凝胶色谱法分离蛋白质的原理。 该方法的核心是利用不同体积(大小)蛋白质在凝胶中的迁移速度差异进行分离。 回答凝胶色谱又称分配色谱，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所使用的凝胶实际上是几个微小的多孔球体，这些小球体多由多糖类化合物构成，小球体内部有许多穿透路径，含有各种分子的样品溶液慢慢流动时，各分子在柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和不规则的扩散运动。 36、相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶粒子内部，只能分布在粒子间，通过的程度短，移动速度快的相对分子质量小的蛋白质分子容易进入凝胶内的通道，通过的程度长，移动速度慢。 因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象也称为分子筛现象。 另外，凝胶本身具有三维网状结构，分子质量大的分子通过该网状结构上的空隙时阻力大，分子质量小的分子通过时阻力小，因此能够分离出分子质量不同的蛋白质分子。 37、2 .回答在一定范围内，外来少量强酸、强碱或即使稀释一点溶液的pH也不会显着变化的作用称为缓冲作用，具有缓冲作用的溶液称为缓冲溶液。 缓冲溶液通常是将一种或两种化合物(缓冲剂)溶解在水中制成的，通过调节缓冲剂的配合比可以制成pH范围不同的缓冲液。 缓冲溶液的作用是保持反应体系的pH值。 在生物体内进行的各种生化工艺都是在正确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格控制。 为了在实验室条件下准确模拟生物体内环境，必须使体外生化反应过程保持与生物体内反应过程完全相同的pH值。 38、