干细胞及成体细胞(教学PPT)

干细胞技术及其应用前景2、干细胞研究史，1996年7月5日，苏格兰爱丁堡郊外罗斯林研究所应用核转移技术克隆大羔羊，伊恩威尔马特以着名乡村歌手多莉帕顿命名。 3、核转移技术，4、第一节概述，5、干细胞(stemcell )是具有自我更新能力和多向分化能力的未分化或低分化原始细胞群，又称万能细胞。 通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核较大，核为常染色质，具有高端粒酶活性，不同干细胞有不同的蛋白质标记分子，可以定位干细胞，作为分离纯化干细胞的标记。 一、干细胞的定义，六二、干细胞增殖特点，一、增殖缓慢(一)干细胞对外界信号作出反应，决定细胞的发展方向增殖或分化。 (2)减少基因突变的危险。 如果增殖慢，干细胞就有时间发现并纠正增殖周期过程中的错误。 2 .自我稳定性是指干细胞在个人生命过程中自我更新，其数量可以保持一定。 干细胞通过其特有的分裂方式维持着自我稳定性。 7、干细胞分裂方式，干细胞有对称和不对称两种分裂方式。 非对称分裂的结果是两个子细胞分别成为一个早起的祖细胞，另一个是保持干细胞的特征。 意义：使机体对干细胞的控制更加灵活，适应机体的生理变化。 为了使干细胞数量保持一定，要求机体更准确地控制干细胞的分裂。 8、(1)根据其分化可能性的大小，干细胞可分为3类。 一是全能干细胞，二是多能干细胞，三是单能干细胞。 二、干细胞的分化特征；(1)全能干细胞(totipotentstemcells )是指具有分化为构成生命个体的所有种类细胞的能力的细胞。 例如胚胎干细胞(2)多能干细胞(pluripotentstemcell )具有产生多种分化细胞的能力，但是在完全个体中丧失发育能力，是指只能分化为特定组织和器官等特定群体的细胞。 例如，骨髓造血干细胞，9，(3)单能干细胞(multipotentstemcell )也称为专业，偏能干细胞，是指除了自我复制以外，只能分化为一种子代类型的细胞。 肌肉中的成肌细胞等。 根据10、全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞、11、胚胎(57天)、受精卵、胚胎、胎组织、成人、12、(2)干细胞的来源，可分为胚胎干细胞、成体干细胞和其他诱导多能干细胞。 (1)胚胎来源的胚胎干细胞ESC(EmbryonicStemCell )来源于哺乳类胚胎发育快、胚期内的细胞块细胞，在体外培养条件下，可在体外无限复制，分化为体内任何类型的细胞。 例如ES细胞、EG细胞、EC细胞等。 13，(2)来自成体成体组织的干细胞ASC(AdultStemCell )是指在成体组织中不分化、有自我更新、具有构建和补充某组织的各种细胞潜力的干细胞，也称为组织特异性干细胞(tissue-specificicsstemcell )。 它们主要维持细胞功能的稳定，具有修复和再生能力，产生新干细胞，或在一定过程中分化，形成新的功能细胞，保持组织和器官生长和衰退的动态平衡。 例如神经干细胞、表皮干细胞。 14、(3)诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC )来源于终末分化的体细胞，通过重编程反转为多能干细胞。15、16、第二节成体干细胞的分离培养，17、一、成体干细胞的来源，骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠上皮、胰腺和脂肪的特征：多向分化、自我更新、可塑性、18、19、成体干细胞的优点： (1)比较容易获得(2) 患者自身来源的成体干细胞在应用时没有组织相容性问题，避免了移植排斥反应和免疫抑制剂的使用(3)胚胎干细胞分化具有“非定位性”，目前无法控制胚胎干细胞在特定部位分化为相应的细胞，容易导致畸胎瘤。 理论上，成体干细胞的肿瘤风险低，伦理争议少(4)成体干细胞也可能是类胚胎干细胞的多向分化。 20、造血干细胞(HematopoieticStemCells，HSC )是指具有自我更新能力和多向分化潜能的最原始造血细胞。 造血干细胞来源：骨髓、外周血、脐带血、胎儿造血系统。 另一方面，造血干细胞，21，不同来源造血干细胞的比较：22，23，造血干细胞的表面标记，人造血干细胞的表面标记为CD34，CD38-，Lin-，Thy-1，Sca-1，HLA-DR，LFA-1，CD45RA-，CD71-等。 人造血干细胞对5 -氟尿嘧啶和4 -氢过氧环磷酰胺也有耐性。 表面标记多，临床应用最多的是CD34。 激酶插入区受体KDR(kinaseinsertdomainrecepter )也可以协同鉴定造血干细胞和造血祖细胞。 24、造血干细胞的表面标记显示，免疫细胞化学、流式细胞仪、分子杂交和PCR等多种细胞生物学和分子生物学手段均可检测造血干细胞。 即使是现在，依据CD34细胞的丰富度来筛选造血干细胞的情况也很多。 方法：密度梯度离心、拒染和抗原标志物进行密度梯度离心、流式细胞术、免疫珠分离、平面粘附分离等，造血干细胞分离纯化，25，(1)流式细胞术、流式细胞术(FlowCytoMetry，FCM )对悬浮液中单细胞和其他生物颗粒进行标志物荧光原理：使液体中悬浮分散的标记荧光的细胞和微粒逐个穿过样品池，同时用荧光传感器捕获荧光信号，转换成表示不同于前向散射角、侧向散射角的荧光强度的电脉冲信号，通过计算机处理形成对应的点图，并加入直方图和三维结构图像进行分析。 26、27、28、(2)免疫微珠分离、免疫微珠法分离细胞根据细胞表面抗原能与微珠连接的特异性单抗结合，磁场施加中通过抗体吸附微珠连接的细胞并滞留在磁场中，这种没有表面抗原的细胞由于无法与微珠连接的特异性单抗结合29，30，免疫珠法分阳性分离法和阴性分离法：阳性分离法-珠结合细胞分离得到的细胞阴性分离法-珠结合的不需要细胞，磁场中游离的细胞是必需的细胞，但阴性分离法的珠用量比阳性分离法多，阳性分离法多。 31、造血干细胞的检查方法证实，小鼠造血干细胞的唯一标准是长期继承下来的体内重建造血能力(Long-termrepopulation，LTR )检查。 羊子宫管羊移植系统。 该系统通过在胎羊免疫系统发达前在子宫内将造血细胞移植到胚胎羊，产生羔羊后跟踪其体内不同血细胞系的分布和比例来判断移植的造血干细胞是否具有长期重建多系统造血的能力来源：个体发育中骨髓腔用流式细胞仪分析，特异性表面抗原为SH2、SH3、CD90、CD71、CD44等。33、分化潜力、间充质干细胞可分化为多种间充质组织，34、16、MSC具有在低血清培养基上贴壁的优势，定期更换液体去除不贴壁的细胞，纯化MSC进行扩增，根据差速壁法、骨髓中各细胞成分的比重不同，分离单核细胞进行贴壁培养，密度梯度离心法， MSC的主要分离手段，流或珠筛选后细胞增殖成本低，技术难度高，限制了这些方法的广泛应用，流式细胞仪法、免疫珠法、35、全骨髓标本、分离方法、培养约24小时后，未粘附细胞：造血干细胞、造血后代细胞、粘附细胞： MSC呈纺锤形， 脂肪、皮肤、骨髓提取物取1.073/ml密度界面的细胞，贴壁生长的细胞9598%为MSC。 从细胞表面抗原中获得MSC。 (1)差速壁法，36，(2)密度梯度离心法是在粒子间存在沉降系数差时，粒子在一定的离心力下分别以一定的速度沉降，在密度梯度不同的区域形成区带的方法。 37、MSC的应用，由于间质细胞在体外较容易诱导骨细胞、软骨细胞，因此广泛应用于骨损伤、先天性骨畸形的治疗。 容易分离，放大快。 可以研究分化过程中信号转导系统、基因表达差异等，为进一步阐明其分化机制奠定基础。 38、第三节干细胞应用研究，39，1、移植研究器官功能恢复，1 .细胞治疗。 干细胞能够恢复在重大疾病中受损的细胞，这是干细胞潜在的最大优势。 失去正常细胞功能的疾病，可通过移植由胚胎干细胞分化的特异组织细胞来治疗。 大人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，所以不能自己修复。 可以用人胚胎干细胞直接分化为细胞进行移植。 40，2 .基因治疗。 即胚胎干细胞和基因工程技术矫正缺陷基因。 干细胞可以自我复制更新，是基因治疗的理想靶细胞。 将治疗基因整合到干细胞中，将干细胞移植到人体中，就像分化的细胞一样，在细胞更新中治疗基因的