超微结构学概述.ppt

生物医学超微结构Biomedicalultrastructure概论,吴晓英教授中南大学湘雅病理系,一、超微结构简介1.概念conception显微结构（microscopicstructure）是指在分辨本领约为0.2微米的光学显微镜下所能观察到的细胞结构，如核仁、线粒体、中心体等。,2,亚显微结构（submicroscopicstructure）是指用光学显微镜观察不到，必须用电子显微镜或其他技术才能见到的细胞微细结构。,超微结构（ultrastructure,finestructureultrastructure;electronmicroscopy）是指细胞或组织在分子水平或亚显微水平的结构，即指在电子显微镜下显示的结构。电子显微镜能观察的范围很广，从细胞内的各种细胞器，细胞的表面结构和各种细胞连接及细菌（含纳米细菌）、支原体和病毒等各种病原微生物，甚至能看到分子结构（如DNA的结构）,以及原子结构（如已见到钨的原子结构）。在电镜下,亚显微结构与超微结构不具有明显界限,统称“超微结构”,4,(普通光学显微镜的分辨力极限约为0.2微米，细胞膜、内质网膜和核膜的厚度，核糖体、微体、微管和微丝的直径等均小于0.2微米，因而用普通光学显微镜观察不到这些细胞结构，要观察细胞中的各种亚显微结构，必须用分辨力更高的电子显微镜。)超微结构是指分辨范围10A的观察等级.所用仪器是电子显微镜、X线衍射等高级显微设备,“医学超微结构学”是一门交叉性的基础学科，它主要讲述：正常人体组织、细胞及与医学实验相关的动物细胞在电镜下的超微结构，即各种细胞、细胞器、细胞核和膜结构，细胞表面结构及细胞连接等；细菌、支原体、衣原体、霉菌、病毒、寄生虫等病原微生物的超微结构；核酸、脂质体等生物大分子及医用纳米材料等的超微结构。,6,2.意义significance超微结构学的产生，标志着形态学已不仅从细胞、而且深入到亚细胞水平（细胞器），从分子水平去认识、探索结构与功能的关系。,超微结构学在研究中的作用通过光镜观察到的组织病变，对于疾病发生发展的研究以及对疾病的诊断具有非常重要的、不可取代的作用，但某些疾病的病理变化特征并不仅表现在组织水平，且还表现在细胞及亚细胞水平，这需要超微病理学。如HbsAg的发现、细胞凋亡过程的细节在电子显微镜下可以确切观察和印证、探讨HIV感染与复制过程等。,8,超微结构观察在疾病诊断中的作用亚细胞水平乃至分子水平分析观察组织的病变,是组织学与病理学的不可缺少的补充手段,越来越发挥重要的作用。如横文肌肉瘤的诊断:电镜下常能在细胞内检出典型的带有横纹的原始肌原纤维而确诊；黑色瘤的诊断电镜下看到黑色素体即可确诊；神经内分泌系肿瘤的特异性分泌颗粒等。,3.背景与进展background&progress19世纪光学显微镜（LM）的诞生具有划时代的意义，使人们在组织和细胞水平直接观察病变成为可能。由于LM分辨能力的限制，无法深入观察到细胞暨亚细胞水平，但亚细胞水平的结构及改变对人们认识细胞功能往往具有重要的作用。如何提高LM分辨率？突破其倍数瓶颈？,1932年德国的Knoll和Ruska根据电子光学原理，创建了第一台雏形电子显微镜，经过半个世纪的不断改进，电子显微镜及其技术已有长足发展和进步，并日益广泛地应用于医学各学科领域，在此基础上，逐渐形成了超微结构学。我国在20世纪50年代后期即开始此领域的建设工作。目前，全国许多单位均相继开展了超微结构的研究工作。,二、超微结构学的地位及学习方法1.超微病理学的发展及在医学的地位发展与地位是组织学、细胞学的纵深发展。,12,超微结构与超微病理学,电镜,提升教学与科研通过学习超微病理学，了解掌握人体基本组织和细胞常见病的超微病理基本知识，拓宽学生视野，提高分析问题和解决问题的能力；为科研工作者提供了探讨微观领域前所未有的手段和技术平台。为医疗服务，提升诊断水平：器官、组织及细胞超微病理变化具有诊断及鉴别诊断价值。,14,2.学习超微须注意事项局部与整体的关系:电镜下只极小部分，超薄切片获得的样品厚度只有一个细胞的几百分之一。必须同时观察大体和组织，密切结合光镜，重视大超薄切片和低倍电镜的观察，才能获得全面的资料。静态和动态的关系:常规电镜技术不能观察活细胞，故细胞结构是瞬间静态图像，实际上细胞是运动和变化，细胞超微结构是动态的，防止单纯的形态描述。,重视半薄切片:生物样品普通石蜡切片厚度为5m左右,其观察深度远比超薄切片为大,即石蜡切片和超薄切片之间不仅有观察范围大小的区别,也有观察厚度的显著差异。半薄切片厚度为1m左右,一是可为超薄切片定位，以选取电镜下需观察部位,二是可供光镜观察标本的整体面貌。制作半薄切片的材料和技术流程差异，其中某些组织成分得以较好保存和得以显示，且半薄切片又较普通石蜡切片薄，可检见通常在石蜡切片难以检见的形态结构,有利于诊断。,了解电镜等仪器的性能：电镜的分辨本领虽已远胜于光镜，但电镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。其他的问题，如电子枪亮度和电子透镜质量等问题也有待继续研究。X线衍射,三、超微结构学的必备技术平台1.仪器：电子显微镜(electronmicroscope,简称电镜或EM)及制样设备：透射电镜(TransmissonEM,TEM):内部结构扫描电镜(ScanningEM,SEM):表面超微结构2.样品制备技术或电镜技术(electronmicroscopy)：超薄切片技术等3.图象识别和处理技术：诊断医师及技术员,1.何为电镜？电镜是使用电子来展示物件的内部或表面结构的显微镜。观察对象：无机材料：材料科学、化工、采矿有机材料：生物、医学用电镜：实质上是一类工具，是显微镜的一种！但系大型、贵重、精密仪器,其原理、结构与光镜显著不同！,2.电镜基本原理电子具有波粒二像性且其波长比可见光（光子）的波长短，短波长能极大地提高分辨率（光镜受可见光波长限制，其分辨率约200纳米)。高速运动的电子在电场或磁场的作用下，会发生折射，并且能被聚焦，聚焦即能成像。电子射束取代可见光成为可能1932年电镜诞生！,3.电镜种类及其它超微工具按使用目标分：透射电镜（微区分析的主要手段:波谱仪及能谱仪；空间构型：三维重构等）扫描电镜（波谱仪、能谱仪）超高压电镜:加速电压500KV，分辨率高，电离损伤小。分析电镜:5.扫描透射电子显微镜：带扫描附件。,3.电镜种类及其它超微工具按使用目标分：6.扫描隧道显微镜:（根据量子隧道效应来获取反映样品表面形貌及电子态图象）7.原子力显微镜AFM：一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。8.X射线衍射仪:利用X射线衍射原理研究物质内部微观结构的一种大型分析仪器.,电镜按用途分：生物医学用电子显微镜非生物医学用电子显微镜按电子束发射方式分：非场发射：电子枪场发射：,5.主要电镜技术超薄切片技术；负染色技术；SEM电镜样品制备技术；冷冻超薄切片技术；电镜酶细胞化学技术；免疫电子显微镜技术；电镜放射自显影技术；核酸大分子电镜样品制备技术；电子探针；电镜原位杂交技术。,6.透射电镜基本构成,采图统:CCD,4.电镜与光镜的比较,1979年湘雅电镜室成立，购买H600透射电镜,HitachiHT7700外观-2012年病理学新购,32,FeaturesofHT7700(ScreenCamera),HT7700Newoperationenvironment,TecnaiG2SpiritTWIN,S-3400N,EMUC7+FC7冷冻超薄切片机,EMUC7超薄切片机,CCD（ChargeCoupledDevice）即电荷耦合器件主要功能：用来取代传统底片拍照。优点：1.使用方便,工作效率大大提高2.拍摄方便3.便于图片储存和管理4.一次性解决底片来源及成本问题,底装CCD,側装CCD,CCDCamera安装位置,小结：超微结构学的主要内容1、主要：人体细胞及与医学实验相关的动物细胞在电镜下的超微结构，各种细胞器和膜结构，细胞的表面结构及细胞连接，也介绍细胞基质的超微结构，细菌、支原体、衣原体、霉菌、病毒等病原微生物和寄生虫的超微结构，以及与医学有关的纳米材料的超微结构等内容2.电镜原理、电镜生物样品的制备技术,四、细胞常见的超微结构1.细胞膜的超微结构2.主要细胞器（线粒体等）超微结构3.细胞核超微结构,1.细胞膜定义：细胞表面的一层薄膜，把细胞与周围环境分隔。LM：看不清。EM下为单位膜构成：膜的内外二层电子密度高，中间低。主要由脂类和蛋白质构成（液态镶嵌模型学说）。功能：保护、物质交换、免疫。,细胞表面的结构及特化物：细胞外衣：细胞膜外面覆盖一层糖蛋白，呈细分枝状分布在细胞表面，厚度与细胞功能有关。如肠上皮处厚，对细胞连接、识别、免疫和抗酶解有重要意义。微绒毛：所有上皮有指状突起的微绒毛。细胞内褶：常见于具有大量的液体和电解质交换的细胞，如肾小管上皮细胞、胃底腺壁细胞等，褶中含有Mit。纤毛与鞭毛：只存于人体呼吸道和生殖管道，9+2结构构成。细胞连接：紧密连接、中间连接、桥粒、缝隙连接,胞饮小泡(pinosome),胞饮小泡是一种由细胞膜凹陷形成的含有液态物质的小泡，有运输作用。多见于血管内皮细胞。,2.细胞浆及细胞器的基本超微结构细胞基质是细胞膜和核膜之间的无定形物质。细胞器：细胞质内具有一定形态结构和某种特殊功能的有形成分。如线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体（过氧体）、细胞骨架等。包涵物：指除细胞器外，积聚在胞质内有一定形态结构的各种代谢物的总称如糖原、脂肪、蛋白质、分必颗粒和色素。,细胞器线粒体LM下一般看不见，以铁苏木精染色，再精细地分化褪色方可在LM下看见。双层膜构成的囊状小体，粒状、线状、管状，即外、内膜，二者包绕形成内腔，二者之间为外腔，内膜向内腔突起形成嵴，两膜都具有典型的单位膜结构。内外膜区别：a.内膜较外膜厚，通透性很小；b.外膜有孔，内膜无；c.外膜较内膜通透性大内腔内有基质及基质颗粒。,细胞器内质网：RER、SER粗面内质网：结构：由单位膜组成的扁平囊，多个囊间有通道相互连结形成网状结构。分布功能：除RBC外，所有细胞均有粗面内质网。粗面内质网主要参与合成外输性蛋白和溶酶体，故在肝细胞（血浆蛋白)，胰腺细胞内（消化酶）内十分丰富，粗面内质网上有核糖体附着，LM呈嗜碱性。,滑面内质网：结构：由单位膜构成的管泡状结构，滑面内质网上无核糖体附着，LM染色嗜酸性。功能：不同细胞的滑面内质网其功能不同。核糖体：组成：rRNA与蛋白LMF嗜碱性分类：固着（合成外输性蛋），游离性核糖体（合成内输性蛋白）。,大鼠肝细胞胞质内可见由小管小泡组成的滑面内质网（黑“”），胞质内另可见多泡小体（白“”）及高尔基体（黑“”），相邻细胞间有微胆管（白“”）。45000,细胞器高尔基复合体是动物有核细胞内必备的细胞器之一。一般位于核附近，不同类型细胞的高尔基复合体的结构、大小、分布及数量都有很大的差异，并且随细胞的分泌活动而变化。由：扁平囊泡、大囊泡及小囊泡构成。,扁平囊泡：是高尔基复合体中最富特征性的部分，一组高尔基复合体中，一般为38层（也有一层的），重叠一起整齐排列。每一个扁平囊的形状像一个扁圆盘，盘底向核一侧凸出，这个面称形成面（又叫未成熟面），凹面向着质膜一侧称分泌面（又叫成熟面）。,大囊泡：呈球形，直径约0.10.5微米，膜厚约8纳米。多见于扁平囊扩大的末端或成熟面（分泌面）。大泡内的内容物电子密度各异，一般认为与内容物的成分和浓缩程度有关。所以大泡又称分泌泡或浓缩泡。,小囊泡：呈球形，是由一层单位膜包绕而成的结构，散布于扁平囊泡周围，常见于形成面。直径约4080纳米，膜厚约6纳米。,小泡,大鼠肾曲小管上皮细胞，胞质内可见大泡、小泡、扁池组成的高尔基体（黑“”）。30000,细胞器溶酶体（lysosome）溶酶体是由单位膜包围而成的微小细胞器。含有多种水解酶，对外源性有害物质和内源性衰老受损的细胞器具有消化作用，所以溶酶体又被喻为细胞内消化器。分：初级溶酶体、次级溶酶体（又称活动性溶酶体或消化泡）,初级溶酶体（又称原溶酶体）,是新形成的初级溶酶体，由单位膜包绕，大小不一，直径约为2550纳米，在电镜下，为电子密度较高的致密小体。初级溶酶体内仅含水解酶，而无作用底物。,次级溶酶体（又称活动性溶酶体或消化泡）,直径比较大，结构多样，是初级溶酶体进一步发展的功能相，由自嗜体或异嗜体与初级溶酶体融合而成。次级溶酶体分布广泛，一般在各细胞内见到的溶酶体都属此类。根据次级溶酶体的结构多样，又可将次级溶酶体分为：自溶酶体、异溶酶体、混合溶酶体、多泡体、终末溶酶体。,3.细胞核的超微结构真核细胞和原核细胞的主要区别：有无完整的核结构。储存遗传物质，承担DNA的复制、RNA的合成,很大程度上控制细胞的蛋白质合成，影响细胞的各种机能(生长、分化、繁殖、遗传等)。除哺乳类动物RBC及血小板外，真核细胞均有核。有核的细胞失去核则不能繁殖且寿命不长。,完整胞核存在于间期细胞中，包括核被膜、核仁和核质等三部分。,核超微结构核体积、数目、形状、核