下一代测序技术简介ppt课件

.,NextGenerationSequencing(NGS)技术简介,.,Sanger测序,Sanger测序法仍然为基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。（价格昂贵、步骤繁琐、效率低）,.,NGS=NextGenerationSequencing,NGS也称为高通量测序High-throughputSequencing(HTS),第一代测序：SangerSequencing（Sanger测序）,第二代测序：NGS=MassivelyParallelSequencing（大规模平行测序）,第三代测序：NGS=HTS,SingleMoleculeSequencing（高通量、单分子测序）,.,目前NGS的主要三种测序仪器,三种测序仪在高通量水平、测序准确度、存储格式和技术方法上均有差异。,.,三大测序平台的技术特点和差异,.,Roche454测序原理,Roche454焦磷酸测序原理,.,Roche454测序步骤,样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。,一、样品处理,.,Roche454测序步骤,二、文库制备,文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。,.,Roche454测序步骤,三、连接微珠,将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。,.,Roche454测序步骤,四、emRCR,PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。,.,乳液PCR（emRCR）,.,Roche454测序步骤,五、反应板准备、上机测序,454测序的反应板称为PTP（PicoTiterPlate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29m，而测序磁珠的直径为20m，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。,.,.,Roche454测序步骤,六、测序和分析,将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。,.,在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。,.,Illumina测序原理,Illumina合成测序原理,.,Illumina测序流程,.,桥式PCR,.,合成法测序,.,数据读取,.,ABISOLiD测序原理,ABISOLiD连接测序原理,.,ABISOLiD测序流程,制备DNA文库乳液PCR/微珠富集连接酶测序:SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。这样经过五轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列SOLID的双碱基编码矩阵,.,ABISOLiD连接测序原理,探针的5末端标记了1种颜色的荧光染料。探针3端15位为随机碱基，其中第1、2位构成的碱基对表征探针染料类型，而35位的“n”为随机碱基，68位的“z”是可以和任何碱基配对的特殊碱基。SOLiD测序反应的每一轮测序反应会连接第15位的碱基，同时切除第68位的碱基，同时记录下第12位碱基决定的荧光颜色。,.,ABISOLiD连接测序原理,.,ABISOLiD连接测序原理,两个碱基共同决定一个颜色，可以极大的提高测序的准确率。,.,ABISOLiD连接测序原理,五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位.的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3”组成的SOLiD原始颜色序列。,.,454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400bp。虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。,各个测序平台的特点总结,Roche454,Illumina,1.可扩展的超高通量GenomeAnalyzer系统目前每次运行后可获得超过20GB的高品质过滤数据。经优化后通量还有望上升到95GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。2.需要样品量少GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。3.简单、快速、自动化GenomeAnalyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。自动化的流程不减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。,.,1.无以伦比的通量目前SOLiD3系统单次运行能产生50GB的人基因组序列数据，相当于基因组的17倍覆盖度，这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的2.准确性。新的超精确检测模块（ECC模块）将提供高达99.99%的精确性；多达98%的可定位碱基的质量值高于45；更多标签以提高灵敏度和动态范围；高准确性的原始读序，支持无参考序列的数据分析。,各个测序平台的特点总结,ABISOLiD,.,第三代测序平台的比较差异,.,太平洋生物科学公司（PacBios）实时单分子测序方案示意图。A.单个零点启动模式波导纳米结构的侧面图，每个纳米结构含一个DNA聚合酶分子，固定于底部的玻璃面上。波导纳米结构和共焦成像系统确保只对底部进行荧光检测。B.显示了荧光标记的核苷酸底物掺入测序模板的过程。相应的瞬时荧光探测分为5个步骤。,太平洋生物科学公司,.,LifeTechnology公司,IonTorrent半导体测序芯片技术图示。A.该芯片结构设计的逐层显示图。上层为单个的DNA聚合反应的微池，底部两层构成场效应晶体管离子传感器。每个微池有其相对应的场效应晶体管探头，以鉴别每一个pH值的变化。B.侧面图：微池中，DNA聚合酶将两个重复的TTP核苷酸掺入测序片段中。反应过程中释放出的氢离子被下方的场效应晶体管检测到。,.,CompleteGenomics公司,Complete