发酵工程 15-2氨基酸发酵.ppt

氨基酸发酵,一、概述,氨基酸基本结构为：,大约20种氨基酸构成了数目庞大的各种肽类和蛋白质。其中8种氨基酸是人体必需的，它们分别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸。,二、氨基酸的应用与市场,氨基酸的应用是基于它们的营养价值、风味、生理活性和化学特性。主要应用领域是食品、饲料、化妆品、医药，也用作化学工业的中间体。据估计全世界每年氨基酸市场为4050亿美元，其中35%用于食品、50%用于饲料和15%用于医药和化妆品。,1、食品领域,氨基酸大多无味，但它们是自然芳香的前体谷氨酸钠（味精）是所有氨基酸中最大生产品种，全世界年产量达100万吨（中国大陆约为60万吨）。二肽和寡肽大多具有苦味，但二肽L-门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（Aspartame，阿斯巴甜）是个例外，它比蔗糖甜150200倍，现已广泛作为人造甜味剂，应用于低热量的饮料等。目前，阿斯巴甜的世界年产量已超过2万吨。,2、饲料领域,组成蛋白质的氨基酸几乎半数对于动物（如猪和家禽）来说是必需的。蛋氨酸和赖氨酸的全世界年产量分别为35万吨和40万吨。近年来，由于发酵水平的提高，苏氨酸成功地进入饲料市场，估计全世界年产量已达1.5万吨。L-色氨酸也是一种限制性氨基酸，尤其在以玉米为基础的饲料中。但由于生产成本较高，目前L-色氨酸的世界年产量仅500吨（日本400吨），因此还不能广泛作为饲料添加剂使用。,3、医药领域,L-氨基酸输液是术前和术后的营养治疗剂。标准氨基酸输液含有8种必需氨基酸，2种半必需氨基酸（L-精氨酸和L-组氨酸），以及几种非必需氨基酸，通常包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-谷氨酸。,L-精氨酸和L-门冬氨酸或L-谷氨酸盐是高氨和肝紊乱的有效治疗剂；L-门冬氨酸钾镁常用于消除疲劳和治疗心力衰竭和肝脏疾病；L-半胱氨酸可防止组织氧化或钝化、解毒。,4、工业领域,谷氨酸制成的聚谷氨酸树脂具有天然皮革性能，因此可用于制造人造皮革和涂料。谷氨酸还可以制造人造纤维。甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸等可用于制造表面活性剂、缓冲剂和抗氧化剂。,三、氨基酸的生产方法,提取法化学合成法微生物发酵法。1956年，木下竹郎（Kinoshita）首次报道分离出谷氨酸产生菌；次年发酵法工业化生产谷氨酸首先在日本问世。继而迅速掀起一股氨基酸发酵研究的热潮。经过半个世纪的努力，目前几乎所有氨基酸都能用微生物法生产（胱氨酸和半胱氨酸除外）。,氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，这是由于氨基酸的生物合成受到严格的反馈调节。要进行氨基酸发酵，就必须采取某些人为的手段以打破微生物的反馈调节机制，从而大量积累目的氨基酸。,采用微生物法生产氨基酸的情况如下：1）使用野生型细菌生产氨基酸（L-谷氨酸、L-丙氨酸等）；2）使用突变株生产氨基酸（L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸等）；3）使用添加前体的方法生产氨基酸（L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸等）；,4）使用酶法生产氨基酸（L-门冬氨酸、L-丙氨酸、L-二羟苯丙氨酸等）；5）应用基因工程、蛋白质工程和代谢工程方法育成的菌株，进行发酵生产（L-羟脯氨酸）。,谷氨酸发酵,1957年日本率先采用微生物发酵法生产谷氨酸，被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进行代谢控制发酵的阶段。目前全国有近50家工厂生产味精，年产量约为60万吨，居世界首位。,一、菌种,现在经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。它们有很多相似点：革兰氏阳性；不形成芽孢；没有鞭毛，不能运动；都需要生物素作为生长因子；都具有一定的过量合成谷氨酸能力。,目前国内大多数厂家使用的菌种是天津工业微生物研究所选育的天津短杆菌T6-13及其变异株（如复旦大学选育的FM-415、华南理工大学选育的S9114、浙江工学院选育的LS168和天津轻工业学院选育的TG931等菌株）。,二、谷氨酸生物合成途径及调节机制,1、生物合成途径,则1mol葡萄糖可以生成1mol谷氨酸，谷氨酸对糖的重量理论转化率为：,谷氨酸发酵是氮素同化发酵，氨的导入是氨基酸发酵最基本的过程，从谷氨酸生物合成途径可知，氨的导入有三种方式：一是糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸；二是由天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给-酮戊二酸而生成；三是谷氨酸合成酶途径。,在谷氨酸发酵中，糖代谢既受生物素的控制（生物素增加糖代谢的速度，生物素充足时HMP途径在糖酵解中所占比率较高），又受NH4的影响。使用生物素缺乏菌，在NH4存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸；当NH4不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸，但在生物素充足时，NH4几乎不影响糖代谢。,2、细胞膜通透性的调节,谷氨酸的分泌取决于细胞膜的通透性。根据控制机制可将控制因素分为两类：一是生物素、表面活性剂、高级饱和脂肪酸（酯）、油酸及甘油的作用；二是青霉素的作用,三、谷氨酸发酵工艺,L-谷氨酸发酵生产工艺主要包括如下工序：原料预处理；培养基配制；种子培养；发酵；谷氨酸提取与精制。,1、L-谷氨酸发酵生产工艺流程,2、L-谷氨酸发酵原料的预处理已知所有谷氨酸产生菌都不能直接利用淀粉或糊精，而只能以葡萄糖等作为碳源。所用的山芋淀粉、玉米淀粉、大米或木薯淀粉都需先进行水解，制成葡萄糖。1）酸法制水解糖液2）酶法制水解糖液3）糖蜜原料：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中都含有丰富的生物素，不宜直接作为谷氨酸发酵的碳源，发酵前必须进行预处理，去除生物素或将其破坏。,3、谷氨酸发酵培养基的配制1）培养基2）发酵培养基中生物素的控制亚适量。3）发酵培养基中的氮源,谷氨酸分子中氮含量占9.5%，所以培养基中必须提供相对充足的氮源。谷氨酸产生菌的生长和产物合成时期需维持在pH7.0-7.2，而且培养基中铵离子浓度又不宜太高，因此，不宜采用硫酸铵、氯化铵等生理酸性铵盐。氨水也可作为氮源，但由于加入后培养基pH波动太大，故需要采取连续流加方法。尿素是国内谷氨酸发酵中较常用的氮源，因为谷氨酸产生菌具有高活力的尿酶，故可采用分批流加方法，使尿素经尿酶分解而提供铵离子。现在，比较常用的是通入气态氨以补充氮源。,4、谷氨酸发酵生产,发酵初期，糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略上升。延滞期的长短一般为2-4h。接着进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升。但随着氨被利用pH值又下降，溶氧浓度急剧下降，然后又维持一定水平上，菌体浓度迅速增大。这个时期，为了及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.5-7.8，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大量发酵热，需加入消泡剂及冷却，使温度维持在30-32。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。,当菌体生长基本停止就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的-酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所需的氨及维持pH值在7.0-7.2，必须及明流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需要加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成的最适温度36-37。,发酵后期，菌体衰老，糖耗缓慢，残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸度不再增加时，需及时放罐。发酵周期一般为30-36h。,5、谷氨酸提取,一般有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法等，其中以等电点法和离子交换法较普遍。,1）等电点法,2）离子交换法当发酵液的pH值低于3.22时，谷氨酸以阳离子状态存在，可用阳离子交换树脂来提取吸附在树脂上的谷氨酸阳离子，然后用碱液洗下来，收集谷氨酸洗脱流分，经冷却，加盐酸调pH值3.0-3.22进行结晶，再离心分离即得谷氨酸结晶。此法过程简单，周期短，设备省，提取总收率可达80-90%，缺点是酸碱用量大，废液污染环境。,国内工厂普遍采用的是等电点离子交换法提取谷氨酸,6、谷氨酸的中和、去除金属离子、脱色7、结晶,赖氨酸发酵,L-赖氨酸的化学名称为2,6-二氨基己酸，分子式C6H14O2N2。作为第一限制性必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料和医药工业，在平衡氨基酸组成方面起着十分重要的作用。目前绝大部分赖氨酸都是采用发酵法生产。,一、菌种,赖氨酸的直接发酵法生产主要采用短杆菌属和棒杆菌属细菌的各种变异株。与大肠杆菌相比，短杆菌属和棒杆菌的L-赖氨酸生物合成调节机制较为简单，适合作为出发菌株。一般来说，L-赖氨酸产生菌由亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、紫外线（UV）等诱变选育而得。,二、机理,1、L-赖氨酸生物合成途径微生物中的L-赖氨酸生物合成途径自1950年以来逐渐阐明。微生物的L-赖氨酸有两条生物合成途径，即二氨酸庚二酸途径（DAP途径）和-氨基己二酸途径。细菌的L-赖氨酸生物合成途径为DAP途径。,2、L-赖氨酸生物合成反馈调节机制,L-赖氨酸是门冬氨酸族氨基酸合成代谢中4个氨酸酸之一。在它们合成共同途径上第一个酶是门冬氨酸激酶（AK），AK是一个变构酶。,在谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌中的L-赖氨酸合成分支上第一个酶是二氢吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶），它不受末端产物L-赖氨酸的反馈调节。,因此，AK是谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌的L-赖氨酸合成途径中唯一的关键酶。,在乳糖发酵短杆菌中，AK不但受到末端产物L-赖氨酸、L-苏氨酸的协同反馈调节，L-赖氨酸单独过剩时AK活性也被抑制45%。,此外，DDP合成酶还受到门冬氨酸族以外的L-亮氨酸的阻遏。,三、L-赖氨酸产生菌的育种要点,1、解除反馈调节解除反馈调节包括解除代谢产物对关键酶的反馈抑制或阻遏。在DAP途径中，有3个关键酶起限速反应作用。这3个酶分别是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC)、门冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶）。其中PC受门冬氨酸的反馈抑制，AK受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，DDP合成酶受亮氨酸的代谢互锁作用。,AK反馈调节的解除（AK脱敏）:AK（在黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌中）只受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制。,要解除对AK的反馈抑制，可以选用如下结构类似物抗性突变株。S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性（AECr）；-甲基赖氨酸抗性（MLr）；苯酯基赖氨酸抗性（CBLr）；-氯己内酰胺抗性（CCLr）；-氟己内酰胺抗性（FCLr）；-氨基月桂基内酰胺抗性（ALLr）；,L-赖氨酸氧肟酸盐抗性（LysHxr）；-氨基-羟基戊酸抗性（AHVr）；邻甲基苏氨酸抗性（OMTr）；苏氨酸氧肟酸盐抗性（ThrHxr）等。除了选育结构类似物抗性突变株外，还可以选育组合型突变株，如营养缺陷型和结构类似物抗性组合突变株，由于其具有两者的优点，因而可大幅度地提高赖氨酸的产量。,2、切断或减弱支路代谢,选育营养缺陷型或渗漏突变株，即切断或减弱合成蛋氨酸和苏氨酸的分支途径，可达到积累赖氨酸的目的。高丝氨酸渗漏突变株（Hse1）是由于高丝氨酸脱氢酶（HD）活性下降但不完全丧失，使得代谢流发生变化，由原来优先合成高丝氨酸方向转向合成赖氨酸方向。由于生成的苏氨酸量不足于与赖氨酸共同对AK起协同反馈抑制作用，从而使赖氨酸得以积累。,3、解除代谢互锁作用,在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸的生物合成与亮氨酸之间存在着代谢互锁。赖氨酸生物合成分支途径的第一酶DDP合成酶的合成受到亮氨酸阻遏。解除代谢互锁的方法包括：选育亮氨酸缺陷突变株；选育亮氨酸结构类似物抗性突变株；选育亮氨酸温度敏感突变株；选育对苯醌或喹啉衍生物敏感的突变株。,4、增加前体物的合成,选育丙氨酸缺陷型；选育门冬氨酸结构类似抗性突变株；选育强化CO2固定反应的突变株。,5、利用基因工程技术构建赖氨酸工程菌,棒杆菌属（Corynebacterium）催化赖氨酸生物合成酶的基因已被成功克隆。已发现将某些用来催化赖氨酸生物合成酶的基因导入寄主细胞能有效提高赖氨酸的产量。,五、赖氨酸的发酵生产,1、赖氨酸的发酵控制赖氨酸生产菌大多以谷氨酸生产菌为出发菌株，通过选育解除自身的代谢调节获得赖氨酸的高产菌株。,1）培养基中苏氨酸、蛋氨酸的控制赖氨酸生产菌是高丝氨酸缺陷型突变株。苏氨酸和蛋氨酸是赖氨酸生产菌的生长因子。赖氨酸生产菌缺乏蛋白质分解酶，不能直接分解蛋白质，只能将有机氮源水解后才能被利用。,发酵过程中，如果培养基中的苏氨酸和蛋氨酸丰富，就会出现只长菌体，而不产或少产赖氨酸的现象，所以要控制其在亚适量，当菌体生长到一定时间后，转入产酸期。,2）生物素对赖氨酸的影响,赖氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，如果在发酵培养基中限量添加生物素，赖氨酸发酵就会向谷氨酸转换，大量积累谷氨酸；若添加过量生物素，使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶产生反馈抑制作用，则抑制谷氨酸的大量生成，使代谢流向合成门冬氨酸方向。因此，生物素可促进草酰乙酸生成，增加门冬氨酸的供给，提高赖氨酸的产量。,3）赖氨酸发酵的工艺条件,发酵温度前期为32，中后期为34。pH6.5-7.5。发酵过程中，通过添加尿素或氨水来控制pH值，同时尿素和氨水还能为赖氨酸的生