细胞工程-第一章细胞培养室的设置和准备工作

第一章细胞培养室的设置设备和基本条件,细胞工程实验室条件实验室基本组成实验用品与主要设备实验室的生物安全,第一节实验室的基本组成,细胞培养实验室应能进行6方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。,细胞工程实验室设计原则：防止微生物污染和有害因素影响要求：工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘；划分不同功能区或用铝合金隔板隔开。无菌操作区：应在室内较少走动的内侧清洗和消毒：安置在另室实验室基本组成,1、无菌操作室(1)无菌操作室:紫外线灯（臭氧）电子灭菌灯(2)净化工作台：超净工作台,2、培养与观察室,3、制备室,4、储藏室,5、清洗和消毒灭菌室,动物细胞培养室的设置准备室无菌间操作间培养室分析室,单间细胞培养室结构图,植物细胞培养室的设置,植物细胞培养室的设置,温度：一般控制在252光照：光强、光质、光照时间,细胞工程实验室条件实验室基本组成实验用品与主要设备实验室的生物安全,一、动植物细胞工程实验室通用仪器设备,超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,净化工作台可按照实验操作需要设计成为水平或者垂直层流型、开放式或半封闭型台面，采用可调风量风机系统、配置紫外线灭菌灯具、电子灭菌设备和照明灯具等，保证工作区域风速和空气洁净程度始终处于理想状态。,水平层流的洁净台通过工作表面排放高效过滤的空气并直接吹向操作者。这些设备仅仅提供产品保护。垂直层流的洁净台可能在医院药房中是有用的，例如在准备静脉注射药物时需要一个洁净的区域。由于这些设备一般有一个观察窗，空气通常从观察窗下排放到房间。,超净工作台的工作原理,净化工作台使用注意事项,净化工作台应安装在隔离好的无菌间内或清洁无尘的房间内。新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作然后再用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。使用净化工作台前，应先用75乙醇擦洗台面，并提前用紫外线灭菌灯照射3050min杀灭净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转2min后再进行培养操作。净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。,净化工作台使用注意事项,一般情况下，高效过滤器3年更换1次。净化工作台使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用乙醇擦洗台面使之始终保持洁净。净化工作台应定期请专业人员进行功能测试。,简易无菌操作箱：在条件比较简单的实验室进行组织细胞培养实验，可以采用自制的单人或双人无菌操作箱。箱内可安装紫外线灯供消毒灭菌和日光灯照明，操作时仅双手伸人箱内，亦可达到一定的无菌条件。,细胞培养实验室的设备,倒置显微镜：倒置显微镜是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一。若有条件，尚可配置带有照相系统的高质量相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，以便随时观察、记录、摄影细胞生长情况。,干燥箱：用于细胞培养的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。鼓风式电热干燥箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。干燥箱160以上干烤2小时,升温时不能先升温后鼓风面应鼓风与升温同时开始，至100时，停止鼓风。应避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑会影响细胞的生长。消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而导致玻璃器皿损坏，应等候温度自然下降至100以下方可开门。,压力蒸汽消毒器,培养基、试剂、耗材等的灭菌,湿热灭菌，用途广,手提式高压蒸汽消毒器,水纯化装置：水纯化时可采用离子交换纯水装置或蒸馏器。离子交换纯水尚不能有效去除有机物，因此用水时尚需再次蒸馏。进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用2次以上蒸馏水。,目前国内使用较多的是自动双重纯水蒸馏器(石英管加热)，使用方便、安全，蒸馏速度快。,自动双重纯水蒸馏器纯水仪,冰箱：细胞培养室必须配备普通冰箱或冷藏柜及低温冰箱(-20)、超低温冰箱。前者用于储存培养液、生理盐水、Hanks液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。低温冰箱、超低温冰箱则用于储存需要冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。,常用实验仪器和设备,样品、试剂和材料等的保存,温度控制系统-冰箱：40C、-200C、-400C、-800C、-105、-135、-153,离心机及天平：进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用离心机。一般可常规配置4000r/min的台式离心机，例如细胞沉降，使用80100g的离心力即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。另外，可根据需要添置其他类型如大容量成或可调节温度的离心机等。,落地式高速冷冻离心机,样品的分离,参数：转速（离心力）、温度、容量、转子（水平、角、酶标板转子）种类：低速离心机30000rpmmin种类：普通离心机：台式和落地式小于2000无冷冻冷冻离心机：高速小于20000超高速大于20000,注意事项：1、开机设定：平稳；设定的加速度和减速度要低，最好设为3。2、温度：开机后可以先2500rpm空转，直到达到设定温度为止。3、放离心管4、离心完后转子卸下来；擦干水滴5、水平转头不可有空档,电子天平,样品、试剂等的称量,注意事项1、水平2、预热3、超载4、先关后拿5、弃而不返,种类托盘天平1g分析天平电子天平,滤器：目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肪、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用过滤消毒以除去细菌。目前常用的滤器有Zeiss滤器、玻璃滤器和微孔滤器。,pH计精确的pH值测定,注意事项：1、不要用滤纸擦拭玻璃膜2、严禁在脱水性介质如无水乙醇、重铬酸钾等中使用3、电极不能用于强酸、强碱或其他腐蚀性溶液,二、动物细胞工程实验室常用设备,CO2培养箱：温度湿度酸度PH,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h)。箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,气套式加热和水套式加热酸碱度（pH值：7.2-7.4）稳定的温度（37C）较高的相对湿度（95%）稳定的CO2水平（5%）：红外传感器（IR）、热传导传感器（TC）注意事项：压力、消毒、蒸馏水,显微操作仪,显微操作法进行细胞核移,细胞电融合仪,摇床,细胞冷冻储存器：细胞培养工作中常需储存细胞，常用的是液氮容器。液氮容器根据使用需要分为不同的类型及多种规格。,加样器(移液器)：用于吸取、移动液体或添加样本，可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。特别是微量加样器，可保证实验样品(或试剂)含量精确，重复性良好。可高温消毒、多通道的各类移液器可供使用者选择，能确保加样准确、快速、方便且达到无菌要求。,移液器液体试剂的精确取量,使用与校对1、枪头2、轴芯，密闭性3、第一档、第二档（深入液体4毫米）4、校对,培养用器皿：培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。玻璃培养器皿的优点是多数细胞均可生长。易于清洗、消毒，可反复使用，并且透明而便于观察缺点是易碎，清洗时费人力。塑料制培养器皿的优点是一次性使用，厂家已消毒灭菌密封包装，打开包装即可用于细胞培养操作。,常用的培养器皿：培养瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格常以容量(ml)表示，如250mL、100mL、25mL等；进口培养瓶则多以底面积(cm2)表示。培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格(直径)行：10cm、9cm、6cm、3.5cm等,多孔培养板：为塑料制品，可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大旦样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等各种单层生长的细胞在培养器皿中长满时可测细胞数，主要取决于器皿的底表面积和细胞体积的大小。,培养板,培养操作有关的器皿：贮液瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、5mL等。吸管：主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有1mL、2mL，、5mL、10mL等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、温匀及传代细胞。,其他用品：离心管、试管架、装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器，用于存放小件培养物品便于向压消毒的铝(或不锈钢)则饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡胶吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子，冻存细胞用的安瓿瓶或冻存管，不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗，超净工作台上使用的酒精灯，供实验入员操作的清洁消毒手使用的乙醇或其他消毒液的微型喷壶等。,器械：主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有；手术刀或解剖刀、手术的或解剖剪(弯剪及直剪)，用于解剖动物、分离从切剪组织，制备原代培养的材料；眼科虹膜小剪(弯剪或直剪)，用于将组织材料剪成小坎；血管钳及组织镊、眼科镊(弯、直)。用于持取无菌物品(如小盖破片)，央持组织等。,特殊设备酶联免疫检测仪，可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等；旋转培养器；荧光显微镜流式细胞仪等,三、植物细胞工程实验室常用设备,光照培养箱,人工气候室可人工控制光照、温度、湿度、气压和气体成分等因素的密闭隔离设备。,培养瓶,细胞工程实验室条件实验室基本组成实验用品与主要设备实验室的生物安全,生物安全,生物安全防护实验室根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，一级最低，四级最高。P3:生物安全三级实验室,生物安全防护水平（BSL）由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全水平.一级生物安全防护水平（BSL1）二级生物安全防护水平（BSL2）三级生物安全防护水平（BSL3）四级生物安全防护水平（BSL4）,biosafetylevels(BSL),生物安全一级(BSL-1)：适合于非常熟悉的病原，不会经常引发健康成人疾病，对实验人员和环境潜在危险小。一般也不使用特殊的遏制设备和设施。生物安全二级(BSL2)：适合于对人和环境有中度潜在危险的病原，应在生物安全柜中或其它物理遏制设备中进行。生物安全三级(BSL3)：该会引发严重的、可能致死的疾病的病原。在生物安全柜或其他物理遏制装置中进行，或由穿戴合适防护服及设施的实验人员进行。实验室经过特殊设计和施工。生物安全四级(BSL4)：处理特别危险的传染原,生物安全柜的选择,WHOLabbiosafety,Pneumococcus:肺炎球菌Salmonella：沙门氏菌,Hepatitis:肝炎LymeDisease：莱姆病Influenza:流感,Anthrax:炭疽Typhus：斑疹伤寒HIV:,Ebol