第九章-基因文库与克隆分析应用(新)PPT课件

第9章基因库和克隆分析的应用，1。复习2。获得目标基因3。外源基因表达系统4。克隆分析的应用。克隆的基本步骤(重组技术):靶基因的获得：供体生物基因或外源基因的获得和纯化载体的选择性限制性内切酶消化：在靶基因和载体之间形成粘性末端纯化连接：将靶基因转化为载体：将该重组DNA分子转移到受体细胞中进行筛选和鉴定：筛选和鉴定吸收重组DNA的受体细胞的基因表达：培养，检测外源基因表达产物，综述，综述，综述，1。限制性内切核酸酶被定义为限制性修饰系统的一个组成部分。识别双链DNA分子中特定核酸序列并因此切割双链DNA结构的酶统称为限制性内切酶。限制性内切酶的发现Luria和人类发现细菌可以在某些特定位点切断外来的DNA片段。为了确保它们不被外来噬菌体感染，它们的DNA被一种特殊的酶修饰(甲基化)并受到保护。这种现象被称为限制修改。限制性内切酶。4、质粒的基本生物学特征：自主复制：携带自身的复制起始区(ori)，它可以独立于宿主细胞的染色体DNA进行复制。不相容性：如果不同的质粒被引入同一个细胞，它们将相互竞争，复制更快。结果，经过几代细菌繁殖后，大多数子细胞含有显性质粒，因此两种质粒中只有一种能在细胞中长时间稳定存在。稳定性：质粒在宿主细胞中保持一定数量的球茎。寄生作用：质粒只能在宿主细胞中复制。表型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的耐药性等。综述，综述，5，(1)原核基因文库的构建，(2)真核靶基因的获得，(2)靶基因的获得，(6，2)靶基因的获得，(1)原核基因文库的构建，(1)限制性酶消化：酶解提取的总DNA以产生所有可能大小的片段。2.载体连接：通过电泳分离的DNA片段与载体连接。3.转化：将含有外源DNA的载体导入宿主细胞。化学法是在0的条件下，用10毫升二氧化氯处理低渗透性的细胞，使细胞膨胀，加入的DNA可以吸附在细胞表面，在42热激后，将DNA吸入细胞.为了获得目标基因，电穿孔使用高压脉冲在宿主细胞表面形成临时微孔，质粒DNA可以进入。4。重组体的筛选和鉴定通常采用以下方法进行筛选和鉴定：A、抗生素抗性筛选；B、抗性插入灭活。8，c，蓝白色斑点筛选如含有LacZ基因(编码半乳糖苷酶)的pUC质粒，它能分解显色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变成蓝色。当插入外源DNA时，LacZ基因不能表达，菌株为白色，这被称为蓝白色斑点筛选。(1)细胞总核糖核酸的分离和提取(2)从其它核糖核酸中分离核糖核酸(2)核糖核酸仅占总核糖核酸的1-2%，并且可以通过核磁共振(A)从其它核糖核酸中分离出来(p-108)。(3)在以其为模板通过反转录合成的第一条cDNA链的mRNA被纯化后，加入寡聚核苷酸(dT)作为引物来指导DNA链的合成，同时加入逆转录酶和四个脱氧核糖核酸(dNTP)以形成核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交分子。(2)获得目标基因，(11)获得目标基因，(4)通过核糖核酸酶解除去核糖核酸链，并以该脱氧核糖核酸链为模板反向合成第二条脱氧核糖核酸链。S1核酸酶被用来打开发夹结构，并将双链DNA分子的两端切平。获得的cDNA。克隆到载体中构成了一个cDNA文库。(P-109)，12，1。样本处理。组织：取50-100毫克的组织(新鲜组织或在-70和液氮中保存的组织)，放入1.5毫升离心管中，加入1毫升乙醇充分匀浆，室温放置5分钟(P-108)。2。获得目标基因，提取核糖核酸。13，2。加入0.2毫升氯仿，摇匀15秒，静置2分钟。3.4，12000克离心15米4.加入0.5毫升异丙醇，轻轻混合试管中的液体，室温放置10分钟。在5.4离心10分钟，弃去上清液。6.加入1毫升75%的乙醇，轻轻清洗沉淀物。4，7500g5min分钟，弃去上清液。7.风干，加入适量DEPCH2O溶解(在65下促进溶解10-15分钟)。通过比较来自两种不同组织来源的信使核糖核酸，使用减法杂交来排除相同的部分(即，信使核糖核酸的共表达部分)，并选择不同的和特异性表达的信使核糖核酸，来构建cDNA文库。扣除文库的构建过程，分别从两种不同类型的细胞T和d中提取mRNA T细胞mRNA，反向转录成单链cDNA，将两种细胞总mRNA的共有序列的Mrna和cDNA加到T细胞cDNA中，形成mRNA-cDNA杂交分子，剩下的单链cDNA代表仅存在于T细胞表达中的基因信息。羟基磷灰石色谱柱(HAP)分离从单链和双链核酸中分离的单链cDNA被合成为双链，然后构建成文库。第二，目标基因的获得。3、用聚合酶链反应筛选已知序列的靶基因：根据已知靶基因两端的序列分别合成20 bp引物，靶基因扩增约30个周期。(2)核酸探针筛选：该组分的cDNA文库采用原位核酸探针筛选靶基因。(3)基因芯片法。16，聚合酶链式反应技术概述，聚合酶链式反应系统和方法，聚合酶链式反应的类型和应用，2，靶基因的获取，(1)聚合酶链式反应筛选方法，(17)，聚合酶链式反应概述(聚合酶链式反应)，80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异性强、灵敏度高、产率高、快速、简便、重复性好、易于自动化等突出优点。可以在几个小时内将目标基因或某个特定的DNA片段扩增到100，000甚至100万倍，用于分析和操作。(1)聚合酶链反应筛选方法：嘿。18、聚合酶链反应技术的创造，科兰纳(1971)等。提出了体外DNA变性、适当引物杂交、DNA聚合酶延伸和DNA克隆的设想。1985年，美国塞特斯公司人类遗传学研究室的穆利斯发明了聚合酶链反应技术，使科兰纳的想法成为现实。斋祀等人于1988年将耐热的脱氧核糖核酸聚合酶(Taq)引入聚合酶链反应技术。1989年，美国杂志Science将聚合酶链反应列为十多项重大科学发明中的第一项，将1989年与聚合酶链反应爆炸的那一年相比，穆利斯获得了1993年诺贝尔化学奖。(1)聚合酶链反应筛选方法：嘿。19、聚合酶链反应技术诞生的社会需求和研究需求。20、聚合酶链反应原理，类似于DNA的自然复制过程，聚合酶链反应依赖于与靶序列两端互补的特异性寡核苷酸引物，由变性、退火和延伸三个基本反应步骤组成。(1)模板脱氧核糖核酸变性：将模板脱氧核糖核酸加热到94左右一段时间后，双链模板脱氧核糖核酸或聚合酶链反应扩增形成的双链脱氧核糖核酸解离成单链，与引物结合，为下一轮反应做准备；(2)模板DNA和引物的退火(复性):加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与单链模板DNA的互补序列配对结合；嘿。嘿。引物延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以脱氧核糖核酸为反应底物，靶序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，合成了一条新的与模板DNA链互补的半保守复制链。通过重复循环变性-退火-延伸的三个过程，可以获得更多的“半保守复制链”，并且这个新的链可以成为下一个循环的模板。完成每个周期需要2-4分钟，扩增靶基因需要2-3小时，扩增倍数为几百万倍。达到平台所需的循环次数取决于样本中模板的副本。22，PCR原理，23，PCR循环，PCR原理，24，PCR反应体系，25，总体积为25-50的25-50-100lBuffer dNTP底物引物(2)引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶，PCR反应体系，26，(1)模板单链和双链DNA均可使用。不能与蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶混合聚合酶链反应系统。27，(2)引物浓度100 pmol/100 l反应体系浓度过高，很容易造成模板和引物错配，反应特异性降低。聚合酶链反应反应系统，引物设计：(1)该序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。(2)引物长度应为20-40个碱基。(3)碱基尽可能地随机分布，其中，遗传变异占50-60%。(4)避免在底漆内部形成二级结构。(5)避免两个引物之间的互补序列。(6)引物的3端是关键碱基，需要与模板DNA严格配对；5端没有严格限制，可以引入酶切割位点。28，聚合酶链反应系统，(3)TaqDNA聚合酶(1.0U/100L)反应系统中酶量的增加降低了反应的特异性；酶太少会影响反应产率。29、聚合酶链反应技术的特点，1、特异性，引物和模板DNA的特异性和正确结合；(2)碱基配对原则；(3)TaqDNA聚合酶合成反应的保真度；目标基因的特异性和保守性。聚合酶链反应产物的产量呈指数增长，并且可以将待测试的初始模板以pg (pg=10-12g)的数量级放大到微克(ug=10-6g)的水平。从一百万个细胞中可以检测到一个目标细胞；在病毒检测中，聚合酶链反应的灵敏度可达3 RFU(斑块形成单位)。细菌学的最低检出率是3个细菌。(2)高灵敏度，聚合酶链式反应技术的特点，(31)聚合酶链式反应技术的特点，(3)耐高温的聚合酶链式反应简单快速。反应液加入一次后，在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，扩增反应一般在2小时左右完成。扩增产物通常通过电泳进行分析，不需要同位素。无放射性污染，易于推广。4.样品的纯度要求很低。不需要分离病毒或细菌和培养细胞。粗DNA产物和总RNA都可以用作扩增模板。可通过临床标本如血液、体腔液、冲洗液、头发、细胞、活组织等的粗DNA扩增直接检测。(2) DNA杂交筛选(1) DNA探针是已知的掺有地高辛的基因片段，是以单链DNA为模板，在克氏酶的作用下合成的。该基因片段可用于与待测样品杂交。2.如果目标基因和探针的核苷酸序列相同或相似，可以根据碱基配对的原理进行核酸分子杂交，从而达到检测样本基因的目的。3.地高辛标记的探针与靶基因的DNA链杂交后，通过免疫反应检测。通常通过酶标记的抗地高辛抗体来检测。(3)基因芯片也称为DNA芯片或生物芯片。基因芯片的测序原理：杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交来确定核酸序列的方法。1.具有固定在底物表面的已知序列的寡核苷酸探针。2.溶液中带有荧光标记的核酸序列(文库中的核酸序列)与基因芯片上相应位置的核酸探针产生互补匹配。3.确定荧光强度最强的探针位置，得到一组序列完全互补的探针序列。34，2，靶基因的获得，基因芯片，35，2，靶基因的获得，芯片杂交，36，2，靶基因的获得，信号数据的读取，37，2，靶基因的获得，(4)杂交滞留和释放(5)染色体行走从作为探针的第一重组克隆插入物的一端分离片段，以从文库中筛选第二重组克隆，并且克隆插入物包含与探针和其他染色体序列重叠的序列。从第二个重组克隆的插入片段中，分离末端的小片段以筛选第三个重组克隆，从而重复获得相邻片段，这相当于在染色体上向上移动一步，因此称为染色体行走)。38，4。具有未知序列的目标基因的筛选(1)从蛋白质中早期发现基因的方法，特异性表达的蛋白质的序列分析，核苷酸序列的估计，DNA探针的合成，相应基因的筛选和分离。(2)表达筛选酵母双杂交系统将两种待研究蛋白的基因分别克隆到酵母表达质粒转录激活子的DNA结合域基因和激活域基因上，构建融合表达载体，并从表达产物中分析两种蛋白的相互作用系统。双杂交系统的建立有助于理解真核生物转录起始过程的调控。细胞启动基因的转录需要转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是模块化的，即这些因子通常由两个或多个相互独立的结构域组成，包括转录激活因子发挥功能所必需的脱氧核糖核酸结构域(脱氧核糖核酸结构域，缩写为DB)和转录激活结构域(缩写为AD)。虽然DB单独可以与启动子结合，但它不能激活转录。(3)同源序列搜索在基因库和其他网站上收集了大量的DNA序列数据。同源性比较工具Blastn软件用于寻找基因之间存在的一些保守序列，并可以判断一些新基因的存在。(2)获得目标基因，(43)和(3)外源基因表达系统。基因表达是指将外源基因克隆到表达系统的载体中，并将其导入合适的宿主细胞中进行表达。常用的表达系统是大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。(1)大肠杆菌表达系统1。大肠杆菌表达的特点该培养方法简单，生长快，成本低。人胰岛素基因、生长激素基因和人干扰素基因都在大肠杆菌中表达。外源基因在原核细胞中表达的调控元件外源基因在原核细胞中的表达水平取决于所用的启动子。强启动子在mRNA的初始合成中具有高效率，而弱启动子在合成中具有低效率。(1)大肠杆菌表达载体中常用的启动子腔隙5来自大肠杆菌乳糖操纵子。活化蛋白CAP和cAMP不是必需的，转录只能从乳糖开始。色氨酸启动子来源于大肠杆菌色氨酸操纵子。启动子下游有3个SalI、BamHI和Smal切割位点，外源基因可以插入其中。(2)核糖体结合位点核糖体结合位点(SD序列)对于真核基因在细菌中的高效表达非常重要。因为原核生物基因都有它们特定的可降解序列，所以真核生物