DNA合成PPT课件

核酸的生物合成,本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介绍。,返回,思考,DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“(F)中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。,遗传信息传递的中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,目录,第四节基因工程及分子生物学技术简介,第一节DNA的生物合成,第二节DNA重组第三节核酸合成的抑制剂,第一节DNA的生物合成,一、DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）,三、DNA突变,四、DNA的损伤与修复,二、逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）,一、DNA的半保留复制,1、概念和实验依据DNA合成的通式及方向,2、原核生物DNA聚合反应有关的酶类3、原核细胞DNA的复制的起始点和方式,5、DNA复制的忠实性6、真核细胞DNA的复制,4、原核细胞DNA的复制过程F半不连续复制),DNA的半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,原核生物DNA聚合反应有关的酶类,（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引发体(primosome)：启动RNA引物链的合成。(3）DNA连接酶（DNAligase）（4）DNA解链酶(DNAhelicase)(5）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。(6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。,复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109-1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:,a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则）,b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5外切酶切除）,c、起始时以RNA作为引物,DNA的半保留复制实验依据,1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.,15NDNA,14N-15NDNA,14NDNA,14N-15NDNA,DNA合成的通式及方向,DNA合成是以4种dNTP(N=A,T,G,C)为底物，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3-OH添加脱氧核苷酸使链延长的过程。,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,DNA复制的方式,复制叉,复制叉,未复制DNA,单向复制,双向复制,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,大肠杆菌有三种DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3聚合酶作用3-5核酸外切酶作用5-3核酸外切酶作用聚合速度(核苷酸/分)持续合成能力主要功能,PolPolPol,109,000400+1000-12003-200DNA修复RNA引物切除,120,000100+-24001500DNA修复,400,00010-20+15000-60000500000DNA复制,比较项目,DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶,DNApolymeraseI,大片段(Klenowfragment),小片段,5-3聚合酶作用3-5核酸外切酶作用,5-3核酸外切酶作用,DNA聚合酶全酶,DNA聚合酶二聚体,primase,Aprimosomeisacomplexofsevenproteins:DnaGprimase,DnaBhelicase,DnaChelicaseassistant,DnaT,PriA,PriB,andPriC.,DNALigase,ligasefrommanybacteria,/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html,不能催化单链DNA连接必须具有粘性末端双链DNA，而不是平齐末端羟基和磷酸基团必须相邻,DNAhelicase,IfIwereanenzyme,IwouldbeDNAhelicase,soIcouldunzipyourgenes,Single-strandedDNAbindingprotein,fromM.tuberculosis,M.lepraeandM.megmatis,SSB,topoisomerase,cutsonestrandofaDNAdoublehelixandthenreannealsthecutstrand.,cutsbothstrandsofoneDNAdoublehelix,passesanotherunbrokenDNAstrandthroughit,andthenreannealsthecutstrand,TypeI,TypeII,DNA聚合酶催化的链延长反应,子链,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3聚合酶作用3-5核酸外切酶作用5-3核酸外切酶作用转化率,DNA聚合酶,DNA聚合酶（复合物）,109，000400+1,120，000100+-0.05,400，00010-20+50,比较项目,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,DNA聚合酶的校对功能,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,真核细胞DNA复制的特点,多个起点复制,端粒（telemere）复制,端粒酶（telomerase）,DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,端粒合成的一种模型,整合和杂交,真核和原核DNA细胞复制比较,二、逆转录作用,1、概念,2、逆转录酶,3、病毒逆转录过程,4、逆转录的生物学意义,扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶,三种功能,逆转录过程中cDNA的合成,逆逆转录病毒的生活周期生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,三、DNA的突变,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,二、诱变剂的作用碱基类似物(baseanalog)碱基修饰剂(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation),一、突变的类型碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation),DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变(framesshiftmutation),四、DNA的损伤与修复,某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤.DNA的修复主要有以下类型:,暗修复,（4）诱导修复（SOS修复）,（1）光裂合酶修复活,（2）切除修复F,（3）重组修复,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,A形成嘧啶二聚体,B光复合酶结合于损伤部位,C修复后酶被释放,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,SOS反应的机制,靶基因表达,lexA靶基因表达但产物被分解,recA大量表达,RecA促使分解LexA,未诱导的细胞,诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),第二节DNA重组,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组，DNA的重组广泛存在与各类生物，真核生物在减数分裂过程中两条同源染色体之间的交换，在噬菌体的整合过程中，在转座过程中都发生DNA的重组。DNA重组在生物进化中起着重要作用。,同源重组位点专一性重组转座重组,同源重组homologousrecombination,指由两条具有同源性的DNA分子，通过错配，链的断裂和再连接，产生片段交换的过程。真核生物染色体的交换，细菌及某些低等生物的转化，以及重组修复都属于这一类。,位点专一性重组sitespecificrecombination,噬菌体基因组插入到细菌基因组染色体上的方式就是位点专一性重组，这个过程也叫整合。这种重组方式需要噬菌体DNA和细菌DNA上的专一性位点，催化这个重要过程的酶只能作用于这对专一性位点。,转座重组transpositionalrecombination,转座重组指DNA上的核苷酸序列在不同染色体之间或同一染色体的不同区段之间移动，这些可以移动的DNA片段就是转座子。转座子最早在玉米中发现，目前在所有的生物中都发现了转座子。,ConservativeTranspositionReplicativeTranspositionRetrotransposition,第三节核酸合成的抑制剂,核苷酸合成抑制剂,氨基酸类似物叶酸类似物碱基和核苷酸类似物,嵌合剂烷化剂,与DNA模板结合的抑制剂,作用于DNA聚合酶或RNA集合酶的抑制剂,抗菌素:如利福平、曲张霉素有机化合物：如磷羧基乙酸,第四节基因工程及分子生物学技术简介,一、基因工程二、体细胞克隆技术三、聚合酶键式反应（polymerasechainreaction,PCR）,一、基因工程简介,基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,基因工程的操作技术基因工程的应用与前景,基因工程的操作技术,1、体外基因重组目的基因的制备载体的构建：质粒或噬菌体目的基因与载体重组,2、重组体DNA的转化增殖和表达转化筛选增殖和基因表达,大白鼠的生长激素基因插入到一个质粒中去，在金属巯基蛋白启动子旁边，这个启动子被金属镉所活化,三、PCR技术原理示意图,DNA和RNA合成的比较,基因工程的应用和前景,建立基因文库。基因文库的建立有利于研究基因结构、基因表达调控机制、个体发育和繁殖的机理、疾病发病机制等