酶的生产工艺

.,主讲：卢昂,组员：牛志鹏、朱聪、陈超英、李东根、王振立,.,产酶细胞应具备的条件：酶的产量高容易培养和管理产酶性能稳定利于酶产品的分离纯化安全可靠,酶类生产工艺,.,淀粉酶脂肪酶蛋白酶纤维素酶,第一节工业用酶,.,一、淀粉酶,淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称，广泛应用于饴糖生产、各种发酵生产的糖化工序、纺织工业的退浆工序、医药和造纸等方面。根据其作用方式的不同可分为：-淀粉酶、-淀粉酶、异淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。其中以-淀粉酶最常用。,.,（一）发酵工艺,菌种选择我国用发酵法生产淀粉酶的常用菌种为枯草芽孢杆菌，如BF-7658菌株。培养基枯草芽孢杆菌BF-7658的诱变菌株Ning作为试验菌株，在10L发酵罐中，采用的培养基组成为:玉米粉7%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.5%，硫酸铵0.4%，氯化钠0.15%。培养条件为:温度(37士1)C，罐压0.05MPa，转速360r/min，风量1:(l-1.2)，培养时间28h，获得酶活力为397.2U/mL的-淀粉酶。发酵过程种子培养和发酵培养,.,（二）-淀粉酶的提取工艺,1.生产工艺流程2.提取工艺3.精制工艺,.,1）热处理工业上发酵结束后，在搅拌下加人无水CaClO.8%(W/V)，升温至50-55C，保温0.5h，冷至35-38C，并调pH6.7-6.8，加(NH4)2S04或Na2S04盐析，静置数小时，即可压滤收集酶饼。2)盐析热处理后可以直接加中性盐盐析，也可以将发酵液经压滤除去菌体和培养基残渣后再盐析。3)干燥滤饼一般先经烘房干燥，再用气流干燥而得成品。,提取工艺,.,精制工艺,生产食品级产品需要进行提取和精制处理。提取的精制设备是板框压滤机和超滤器。使用板框压滤机除去发酵液中的菌体和杂质，得到较纯的酶液滤饼，含水量要求小于45%含酶小于100U。将得到的酶液再进行防腐和调配处理便成为产品。,.,二、脂肪酶,三酰基甘油基水解酶，可水解三酰甘油酯为甘油和脂肪酸广泛存在于动植物和微生物内微生物脂肪酶的种类很多，广泛存在于细菌，酵母和霉菌,.,三、蛋白酶,蛋白酶是指催化蛋白质肽键断裂的一类酶，将蛋白质降解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸，广泛存在于动植物以及微生物细胞内，按其作用形式可分为肽链内切酶、肽链外切酶。在蛋白酶的生产应用中按其作用条件分为酸性蛋白酶(如凝乳酶)和中性蛋白酶。工业最大用途洗涤剂，为碱性蛋白酶。,.,蛋白酶的生产工艺流程,生产菌发酵工艺提取工艺酶的质量测定,.,1.生产菌,蛋白酶分布广，但由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用细菌和霉。酸性蛋白酶(最适pH2-5)产生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉等;中性蛋白酶(最适pH7-8)产生菌主要是枯草芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌等;碱性蛋白酶(最适pH9-11)主要产生菌为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等。,.,2.发酵工艺,（1）培养基米曲霉的培养基:豆饼粉7.5%，(NH4)2S040.8%，水40%，KH2P040.25%，麸皮51.45%。黑曲霉的培养基(g/L):新鲜麸皮8.25，米糠4.5，豆饼粉1.5，(NH4)2S04O.3，K2HP04O.06，CaCl20.075，水8.6mL，pH5.5。（2）工艺流程（3）发酵条件装料量30g/250mL三角瓶，采用变温培养，32堆积培养48h，进行翻料，将温度调至28继续培养至120h。,.,3.提取工艺,取发酵原料，以缓冲溶液浸提后，离心获得粗酶粉。浓缩酶制备工艺流程为:发酵液絮凝离心活性炭脱色纸板过滤超滤浓缩。（1)絮凝取刚下罐的发酵液100mL，加人质量分数为0.1%的絮凝剂NaAl02，室温搅拌10min，然后倒人100mL量筒中观察沉降情况，并记录清液出现时间为分层时间，每隔5min测定清液高度，至120min为止。(2)离心将发酵液装人离心管中，在4条件下8000r/min离心。(3)脱色选择中颗粒活性炭进行发酵液脱色，用量为1%。(4)纸板过滤过滤纸板由孔径30-50m的棉花纤维、石棉和硅藻土组成，纸板过撞机的压力为0.3MPa。(5)膜浓缩由于蛋白酶的分子质量为28kDa，因此选用聚丙烯膜的MMCO(截留分子质量)为20kPa，操作压力为0.05MPa，温度控制在lO左右。,.,4.酶的质量测定,酶性质的测定:将一定量冷冻干燥后的酶粉溶于pH3.0乳酸缓冲溶液中，制成酶溶液，测定酶的最适温度和pH，通过Sephadex-G75凝胶过滤层析及SDS-PAGE蛋白质电泳分析，此蛋白酶的分子质量范围为55-60kDa。,.,四、纤维素酶,1、纤维素酶种类繁多，来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，广泛存在于生物体中，但人和大部分动物体内没有，而反刍动物体内有纤维素酶。用于生产纤维素酶的菌有木酶属、曲霉属和青霉属等。产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。2、纤维素酶应用广泛，在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并可提升酒质。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时还含有半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等。3、自然界中的很多真菌都能分泌纤维素酶，由许多具有高协同作用的酶组成。习惯上将纤维素酶分成三类:内切葡聚糖酶(Cx)、外切葡聚糖酶(Cl)和伊葡萄糖昔酶(G)。,.,（一）生产菌,1.基础菌种产纤维素酶的微生物主要是霉菌，有木霉属、曲霉属和青霉属，此外，反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单胞菌、蒙古细菌、梭状芽抱杆菌等也能产生纤维素酶。2.选育菌种菌种选育是纤维素酶生产的重要基础性工作，国内外许多专家进行了大量研究。以绿色木霉木10、绿色木霉5n-91014、康氏木霉NT-IS、黑曲霉XX-ISA为出发菌株，采用了紫外线、亚硝基胍等理化因素诱变，获得了高产菌株NTlS-H、NTlS-HLXT-lSH、XT-lSHl。其中木霉NT-ISH固体培养活力经轻工部食品质量监督检测中心南京站检测表明，滤纸活力为3670U/g，Cl活力24460U/g，Cx活力1800U/g，已达到国际先进水平。,.,（二）培养基,1、试管斜面培养基:将菌种接种于5g/dL麸皮汁斜面培养基上，28C培养3d后使用或4C保存。2、起始摇瓶培养基:麸皮2g/dL，LAvicel19/dL，KH2P040.2g/dL，蛋白胨0.4g/dL，酵母粉0.02g/dL，其他各种微量元素，自来水配制成100mL，自然pH。3、优化瓶培养基:麸皮335g/dL，LAvicel134g/dL，KH2P040.2g/dL，蛋白胨0.4g/dL，酵母粉0.02g/dL，其他各种微量元素，自来水配制成100mL，自然pH。,.,（三）发酵方法固体发酵,固体发酵法以植物秸杆为主要原料，工艺简单，产品价格低廉。(1)菌种绿色木霉(2)培养基通过对其固态发酵条件进行单因素优化试验来确定发酵培养基的最佳碳、氮源种类及添加量为:稻草粉与麸皮的质量比为9:1，NH4N030.5%(3)发酵培养最适培养条件为:固液比1:3，接种量1mL，pH自然，培养温度30C.培养时间96h。(4)酶的提取目前生产厂家只能采用直接干燥粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙，成品质量不稳定，杂质含量高。因此，随着液体发酵酶工艺的发展及菌种性能的提高，采用液体发酵法生产纤维素酶是必然趋势。（5）工业上生产酶制剂的主要方法为盐析法，盐析剂为硫酸铵。首先以pH4.8的乙酸缓液与酶按体积1:2的比例稀释酶液，在4C、硫酸铵饱和度为70%的条件下提取16h，5000r/min离心20min得到沉淀，即为粗纤维素酶。,.,（三）发酵方法液体发酵,（1）菌种康氏木霉TrichodermakoningiiP12菌株;绿色木霉、里氏木霉。（2）培养基斜面培养基采用麦芽汁琼脂培养基。基本发酵培养基组成为(g/L):稻草粉30，麦麸15，(NH4)2S048，KH2P04O.5，MgSO47H2OO.5，酵母膏1，自来水配制，初始pH5.0，装液量35mL。（3）发酵培养发酵培养条件为:取种子培养5-6d，离心上清液即为粗纤维素酶液。确定最佳发酵条件为:当装液量为56.5mL、稻草粉浓度为37.4g/L和麦麸浓度为11.3g/L时，纤维素酶产量达到63.32U/mL。,.,（四）酶的提取,通过离子交换和凝胶过滤两步层析法，从耐碱芽孢杆菌III-3的培养液中分离到分子质量约为89kDa、比活力高达420U/mg的碱性纤维素酶。具体工艺如下。1.粗提将皿-3菌株的48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，所得上清加入4倍体、pH8.0的Tris-HCI缓冲液，即得粗酶液。2.离子交换层析使用216cmX30cmDEAESepharoseCL6B层析柱。缓冲液体系采用pH8.0的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl、pH8.0的Tris-HCl缓冲液。3.凝胶过滤层析使用的介质为Hiload16/60Superdex200pg预装柱。缓冲液体系采用pH8.0的TrisHCl缓冲液。,.,（五）酶活力的测定,用滤纸方法测定酶活(FPA)，取适当稀释的酶液0.5mL，加人到1.5mlpH4.8、0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液中，再加入1条1cmX6cm新华定量滤纸，50保温1h，加人1.5mLDNS试剂终止酶反应，沸水浴5min，冷却后加水稀释到25mL，用分光光度计在520nm处测还原糖OD值。纤维素酶活力单位的定义:50下，每小时水解底物生成1mol葡萄糖所对应酶活定义为1个酶活国际单位UlU/(mLh)。酶学性质研究结果表明:耐碱芽孢杆菌III-3-A的CMC酶反应以pH9.0、反应温度45左右为宜，在pH6-1l和50以下酶活性稳定，且具有耐金属离子和表面活性剂等特性，Ca2+对酶的最适反应温度和热稳定性有显著影响，添加5mmol/LCaCl2可使最适酶反应温度和稳定性分别提高至50和55。该酶其有耐热、耐金