第13章 细胞衰老与凋亡

上课了！,同学们好！,细胞生物学,第十三章程序性细胞死亡与细胞衰老,程序性细胞死亡细胞衰老,第一节程序性细胞死亡,程序性细胞死亡的涵义动物细胞的程序性死亡植物细胞与酵母细胞的程序性死亡,二、动物细胞的程序性死亡,细胞凋亡(apoptosis)细胞坏死(necrosis)细胞自噬(autophagy),第二节细胞衰老(cellagingorcellsenescence),细胞衰老的概念细胞衰老的研究衰老细胞形态结构的变化细胞衰老的分子机制细胞在体内条件下的衰老细胞衰老与个体衰老的关系,二、细胞衰老的研究,细胞不死说Hayflick界限,一、程序性细胞死亡的涵义,不论是单细胞生物还是多细胞生物，其细胞死亡往往受到细胞内某种由遗传机制决定的“死亡程序”所控制，称为程序性细胞死亡。（programmedcelldeath,PCD）,一、细胞衰老的概念,细胞衰老（cellaging）一般的含义是复制衰老(replicativesenescene，RS)。指体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂,细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。,（一）细胞不死说,1892年，魏斯曼提出:种质不死而体质会衰老和死亡的学说原生动物细胞“不死性”证据原生动物某些无性系可以长期保持很高的分裂速度证据不足被废弃。某些无性系的稳定性的观点,细胞不死说,1912年,AlexisCarrel(NobelLaureate)细胞“不死性”的观点卷土重来证据在实验室培养鸡心脏细胞可以无限制地生长和分裂。（连续培养了34年）,细胞不死说,20世纪40-50年代，L系小鼠和HeLa细胞系的建立。（可以一直分裂、存活下去）使细胞“不死性”的观点的统治地位更加巩固了。,细胞不死说,细胞本身并没有衰老和死亡，衰老只是一种多细胞现象，多细胞生物体内细胞的衰老，起因不在细胞本身，而是由于体内、体外环境的影响。,细胞不死说,谁动摇了这种学说？,Hayflick认为,Carrel的实验不能被重复,可能是由于混入了新鲜的细胞。HeLa癌细胞和培养的L细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞。,Hayflick提出细胞增殖能力和寿命是有限的观点,(二)Hayflick界限(HayflickLimitation）,Hayflick界限的概念细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是Hayflick界限。Hayflick界限的证据细胞的增殖能力与供体年龄有关物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系,一、Hayflick界限(HayflickLimitation）,决定细胞衰老的因素二倍体细胞的衰老是由细胞自身决定的决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老,细胞衰老概念被普遍接受的一些经典实验,(细胞体外生命跨度与供体年龄的正相关性)过程：年轻女性细胞(间期可见巴氏小体)+年老男性细胞(间期无巴氏小体)混合培养(一样的外部环境)结果：年轻女性细胞倍增次数多于年老男性细胞结论：细胞衰老的过程是由细胞自身决定的,而非环境因素,细胞衰老是由细胞核而非细胞质决定的体细胞杂交实验,年老细胞,年轻细胞,年轻细胞,年老细胞,不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数,1.细胞体外生命跨度与物种平均生命跨度的正相关性,早老症病人的细胞在体外只有较短的生命跨度,六、细胞衰老与个体衰老的关系,呈正相关性:成人的细胞能在体外传代的次数比胎儿的细胞少;早老症病人的细胞能在体外传代的次数比正常人少;寿命长的物种的细胞能在体外传代的次数比寿命短的物种的细胞多。,五、细胞在体内条件下的衰老,在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们会不会衰老？衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢.,三、衰老细胞形态结构的变化,细胞核的变化内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了线粒体的变化:通常，细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大致密体的生成膜系统的变化,细胞核的变化,体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化,膜系统的变化,衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小衰老细胞间间隙连接减少;细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化,四、细胞衰老的分子机制,复制衰老的机制端粒与衰老胁迫诱导的早熟性衰老氧化性损伤学说单细胞生物的衰老,结论,细胞衰老可能是以上综合因素的集合，或某几种因素的集合，其中有一种起主导作用。对于不同的生物体可能有不同的导致衰老的诱因和相应的机制。,端粒与衰老,1990年Harley发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说。“有丝分裂钟”学说认为，随着细胞的分裂，染色体末端的（端粒）不断缩短，当其长度缩短到一个阈值时，细胞进入衰老。l细胞每分裂一次，端粒缩短50100bpl端粒缩短到一定程度，细胞不再分裂l端粒酶过量表达能延长细胞的生命跨度,（一）细胞凋亡(Apoptosis),细胞凋亡的概念细胞凋亡的生理意义细胞凋亡的特征细胞凋亡的检测方法诱导细胞凋亡的因子细胞凋亡的分子机制,1.细胞凋亡的概念,细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡方式，受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为，凋亡细胞最后以凋亡小体的形式被吞噬消化。,2.细胞凋亡的生物学意义,细胞凋亡对于多细胞动物个体的正常发育，自稳态的维持，免疫忍受的形成，肿瘤的监控具有重要意义。蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡发育过程中手和足的成形过程脊椎动物的神经系统的发育细胞凋亡失衡会引发多种疾病。细胞凋亡不足细胞凋亡过度,3.细胞凋亡的特征,细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的生化特征,3.1细胞凋亡的形态学特征,动物细胞凋亡的过程可以分为两个阶段：激活期（activationphase)在这一阶段，细胞对要求它进行自我毁灭的“死亡信号”作出反应。执行期（executionphase)细胞死刑此时付诸实施。我们先来看比较容易理解的执行期，由凋亡引起的细胞死亡是一个干净利落的有序过程其特征表现为：,3.1细胞凋亡的形态学特征,凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化,3.2细胞凋亡的生化特征,细胞凋亡的主要特征是形成大小180200bp特征性的DNAladders。凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissueTransglutaminase）积累并达到较高水平。,5.诱导细胞凋亡的因子,物理性因子包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。化学及生物因子包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等。,4.细胞凋亡的检测方法,形态学观测DNA电泳法（DNA片段呈现梯状条带）TUNEL测定法彗星电泳法（cometassay）流式细胞分析,4.1形态学观测,光学显微镜和倒置显微镜观察荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜透射和扫描电子显微镜观察,4.2DNA电泳法,DNA片段（180-200bp)呈现梯状条带,4.3TUNEL测定法(DNA断裂的原位末端标记法),DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。,4.4彗星电泳法,彗星电泳法（cometassay）的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。,4.5流式细胞仪分析,根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶（PI法）使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。,6.细胞凋亡的分子机制,线虫(C.elegans)Caspase家族Bcl-2家族细胞凋亡的分子机理细胞凋亡的调控,细胞凋亡受基因控制，线虫是研究细胞凋亡分子基础的理想材料。每条线虫具有1090个细胞，其中在正常情况下有131个细胞在发育过程中以凋亡的方式死亡。从线虫中找到若干控制细胞凋亡的基因。,6.1线虫(C.elegans),找到若干控制细胞凋亡的基因ced-3、ced-4：诱发、启动、促进细胞凋亡ced-9：基因阻止ced3/ced4的激活，抑制凋亡实验证据ced-3、ced-4：基因突变或缺失，使凋亡受阻移入ced-9：使凋亡受阻失去ced-9：使细胞凋亡,6.2Caspase家族与凋亡,Caspase家族Caspase类型Caspase激活Caspase水解的靶蛋白,Ced3的哺乳类同源基因是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase-1。Ced4的哺乳类同源基因是Apaf-1(细胞凋亡蛋白活化因子）。Ced9的哺乳类同源基因是BCL-2。Caspase家族是一组与众不同的蛋白水解酶，在凋亡早期阶段被激活，并负责引发随后的凋亡变化，通过切割一组高度选择性的必须蛋白质来实现这一功能。Caspase活性位点包含半胱氨酸(Cysteine)特异切割靶蛋白中的天冬氨酸残基（asparticacid）后的肽键因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase,动物细胞凋亡的过程可以分为两个阶段：激活期（activationphase)在这一阶段，细胞对要求它进行自我毁灭的“死亡信号”作出反应。执行期（executionphase)细胞死刑此时付诸实施。,Caspases类型,Caspases类型,凋亡起始者Caspases激活期切割执行者前体、产生有活性的执行者Caspases凋亡执行者Caspases执行期执行者Caspases活化后，水解切割细胞质中的结构蛋白和调节蛋白，启动凋亡。,Caspase激活,细胞中合成的Caspase自身以无活性的酶原状态（Procaspase）存在，经激活后方能执行其功能。其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点水解活化或自身活化,胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,上游起始者Caspases切割、活化下游执行者Caspases当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡下游执行者Caspases活化后，水解蛋白底物，启动凋亡裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。,6.3Bcl-2家族与细胞凋亡,Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3Bcl-2蛋白质家族成员以不同的方式调节细胞凋亡促进凋亡:Bad、Bid、Bax阻止凋亡：Bel-X、Bel-w、Bel-2哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC,6.4细胞凋亡的分子机理,Caspase依赖性的细胞凋亡Caspase非依赖性的细胞凋亡,6.4.1Caspase依赖性的细胞凋亡,胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径胞内信号刺激诱导的细胞凋亡途径,胞内信号刺激诱导的细胞凋亡途径,（二）细胞坏死(necrosis),细胞坏死的涵义及特点细胞凋亡与坏死的区别,（二）细胞凋亡与坏死的区别,细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptoticbodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应。,（三）细胞自噬(autophagy),细胞自噬的涵义及特点细胞自噬的分子机制,三、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡,植物细胞的程序性死亡酵母细胞的程序性死亡,caspase超家族成员及其相应底物,BCL-2家族成员,坏死细胞,凋亡细胞,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0h2细胞色素c诱导1h3细胞色素c诱导2h4细胞色素c诱导3h5细胞色素c诱导4h6阴性对照7Marker（自赵允、翟中和）,秀丽隐杆线虫,自由基理论,1956年Harman提出来的生物氧化中产生自由基，自由基破坏生物大分子蛋白质、核酸、脂类等。使得细胞结构破坏，基因突变，导致细胞衰老。,自由基,自由基是一类瞬时形成的含不成对电子的原子或功能基团，普