遗传育种课件

第九章微生物菌种选育,获得菌株途径,直接向菌株保藏机构索取：美国典型菌株保藏中心（ATCC）英国国家典型菌种保藏所（NCTC）日本大阪发酵研究所（IFO）中国微生物菌株保存委员会（CCCCM）从自然界采集样品进行分离：土壤、水、动植物体、含有微生物的产品（酱油、酒醪、酸奶）等,第一节新种分离与筛选,一、新种分离与筛选的原理,分布广不同环境条件下微生物代谢类型、生理特性不同自然条件下微生物混杂生长,菌株分离,将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。,工业微生物产生菌分离筛选工作内容,一是从自然界分离所需要的菌株二是把分离到的野生菌株纯化并进行代谢产物测定,二、菌株分离筛选的步骤,采样增殖培养分离产物鉴别,采样前的准备工作,采样,土壤：了解土壤的特点土壤类型土层深度：525cm土壤酸碱度地理条件季节条件：春季、秋季,采集土样方法,采样操作方法记录：地点、土样知底、植被名称、时间等,根据微生物生理特点采样营养类型生理特性,特殊环境下采样局部特殊环境极端环境,增殖培养（富集培养）,当目标微生物数量较少时，根据微生物的生理特点设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目标微生物在最适条件下迅速生长繁殖，数量增加，变为优势种群，达到利于分离的目的。,富集培养原理,根据微生物所需的碳源、氮源、酸碱度、温度、需氧情况等加以控制,富集培养方法,控制培养基的营养成分控制培养条件抑制不需要的微生物,微生物的分离,稀释涂布法划线分离法组织分离法利用平皿的生化反应进行分离透明圈方法变色圈方法生长圈方法抑菌圈方法,产物鉴别,初筛平板筛选摇瓶发酵筛选复筛,第二节遗传变异的物质基础,一、遗传与变异,遗传：是指亲代传递给子代一整套遗传信息的能力。变异：是指生物体在外因或内因的作用下，引起遗传物质结构或数量改变的现象。,二、一些概念,遗传性（基因型）：是指某一生物个体所含有的全部遗传信息的总和。表现型（表型）：是指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特征的总和，是遗传性在一定条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。表现型基因型+环境条件饰变：是指不涉及到遗传物质改变，而只发生在表现型的改变。,三、证明遗传物质是核酸的3个经典实验,肺炎链球菌转化实验噬菌体感染实验TMV的拆建实验,转化实验,1.转化(transformation)实验:供体菌裂解游离的DNA片段转入某受体菌细胞内的过程。,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,3、植物病毒重建实验,实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。,遗传物质在微生物细胞中的存在形式,细胞水平细胞核水平染色体水平核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,3、染色体水平染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构染色体的数目在不同的生物中是不同的染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。,5、基因水平,基因及基因表达产物的表示方法,p196,6、密码子水平,7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位,原核生物的质粒,概念：是指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。结构：超螺旋结构严紧型质粒与松弛型质粒；质粒消除整合：是指质粒（或温和噬菌体、病毒、转化因子）等小型非染色体DNA插入核基因组等大型DNA分子中的现象。,质粒的种类,（1）致育因子(Fertilityfactor，F因子),又称F质粒，其大小约100kb，cccDNA,这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒,含有与质粒复制和转移有关的许多基因。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。,存在F质粒的细菌,E.coliPseudomonasHaemophilusNeisseriaStreptococcus,（2）抗性因子（Resistancefactor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒,抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuricion，mer）四环素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)、夫西地酸（fusidicacid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,细菌素,由细菌产生的能够产生抑制或杀死其它近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物。,（3）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）,一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。,细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,（4）毒性质粒（virulenceplasmid）,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。,苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子,Ti质粒（诱癌质粒、冠瘿质粒）,Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体,Ri质粒,发根土壤农杆菌（A.rhizogenes）侵入双子叶植物的根部，并诱导生成大量的发状根。,（5）代谢质粒（Metabolicplasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,降解质粒：,假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟脑等的能力。,（6）隐秘质粒（crypticplasmid）,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）,第二节基因突变和诱变育种,基因突变,概念：是指细胞内（或病毒粒子内）遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化。（突变）狭义的突变指基因突变（点突变）广义的突变指基因突变和染色体畸变野生型菌株：突变株：,突变的类型,营养缺陷型突变株：抗性突变株条件致死突变株温度敏感突变株（Ts突变株）形态突变株：个体、菌落（群体）抗原突变株产量突变株正突变株、负突变株,突变率,概念：是指某一细胞（或病毒粒）在每一世代中发生某一性状突变的几率。,基因突变的特点,自发性不对应性稀有性独立性可诱变性稳定性可逆性有害、有益性,证明基因突变自发性和不对应性的实验,变量试验（波动试验、彷徨试验）涂布试验影印平板培养法试验,变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）,SalvadorLuria,MaxDelbruck,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969,彷徨试验(fluctuationtest),影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）,JoshuaLederberg,基因突变的机制,诱发突变（诱变）自发突变,诱变,概念：是指通过人为的方法，利用理化、生物因素提高基因突变率的手段。诱变剂：指具有诱变效应的因素。,诱变机制,碱基的置换微小的损伤（点突变）转换颠换引起碱基置换诱变剂及机理p208,移码突变（码组移动突变）,概念：移码突变株引起移码突变的诱变剂,染色体畸变,DNA大的损伤缺失、重复、倒位、易位染色体结构变化染色体数目变化转座：转座因子：插入序列（IS）、转座子（Tn）、转座噬菌体（Mu噬菌体）,自发突变,概念：原因：环境因素环出效应碱基错配,紫外线对DNA的损伤及修复,嘧啶二聚体光复活作用切除修复（暗修复）,育种技术,自发突变与育种技术诱变育种技术基因重组育种技术杂交育种技术体外基因重组育种技术（基因工程育种技术）,自发突变与育种技术,从生产中育种定向培育优良菌株,生产菌种自然选育流程,定向培育,利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出优良菌株的方法。方法梯度平板培养法,诱变育种技术,诱变育种：是指利用理化诱变剂处理均匀而分散的微生物群体，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速、高效的筛选方法，从中选出优良性状的突变株。,产黄青霉菌NRRL1951.B25（250U/mL）X-射线X-1612（500U/mL）UVQ176（900U/mL、不产黄色素）,诱变育种的一般流程,诱变育种原则之一,选择简便有效诱变剂：诱变剂：Ames试验：诱变剂选用的原则：紫外线、NTG采用简便有效的诱变方法：,诱变剂,物理诱变剂：UV、X-射线、-射线、-射线、-射线、快中子、超声波、离子束、微波化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂（EMS、NTG、DES、氮芥等）、移码突变剂、其它类生物诱变剂：噬菌体,紫外线诱变方法,性质,波长范围：4003900埃（40390nm）最大吸收：260nm,来源,紫外灯15W,紫外线诱变操作方法,诱变前提前2030分钟打开紫外灯（目的：使光波稳定）制备菌悬液：一般用生理盐水取1mL菌悬液做对照吸取45mL菌悬液倾入直径9cm平皿中并盖上皿盖（要求：平皿底部平整）将盛有菌液的平皿置于灯管一定距离下照射（注意：先不打开皿盖照射1分钟，然后打开皿盖开始照射并计时）；此外照射时最好缓慢振荡（目的：使菌液照射均匀）,每隔一定时间取样（0.1mL)，用生理盐水或蒸馏水稀释（注意：稀释度以控制平板上生长的菌落数为准，细菌：50100个；放线菌：4080个；真菌：520个）取处理过菌液和未处理过的对照菌液0.10.3mL，加入平板中涂布置于适宜温度下培养,紫外线诱变育种注意事项,操作、培养时避免可见光，最好在红光灯或黄光灯下操作操作时避免紫外线灼伤紫外灯的规格、质量各厂家不同，要注意选择同一灯具其发射强度会随使用时间延长而下降，在实际工作中要注意,诱变应用情况,处理的菌液的浓度紫外线处理前的预培养：若预培养在富含碱基的培养基内可提高突变率；若预培养在氯霉素或缺乏色氨酸的培养基内突变率会降低紫外线处理后的后培养：照射后在适宜温度下培养一定时间可提高正突变率紫外线照射后复合氯化锂后培养UV-VIS复合处理,亚硝基胍,性质,土黄色结晶难溶于水不稳定，遇光分解并释放NO，同时结晶由土黄色变成黄绿色,特点,为高效诱变剂：在合适条件下，死亡率低而突变率高为超级诱变剂：对每一个细胞可诱发一次或多次突变可引起并发突变（共突变）缺点NG处理液的pH值对其诱变效应有显著影响,诱变育种原则之二,挑选优良的出发菌株出发菌株：用于育种的原始菌株原则：选自生产菌株选生长快、营养要求低的菌株选用遗传背景优良的菌株选用多出发菌株,诱变育种原则之三,处理单孢（胞）悬液目的：使每一个细胞均匀接触诱变剂；防止长出不纯的菌落表型延迟现象：,细菌菌悬液制备方法,肉汤中培养1624hs（浓度：23108/mL）生理盐水洗涤2次用玻璃珠振荡15mins（目的：菌体分散率大于90）用棉花或滤纸过滤（目的：滤除成团菌体）调整菌液浓度（108/mL）,真菌、放线菌孢悬液制备方法,先在斜面上培养，形成孢子用蒸馏水或生理盐水洗下制成孢子液用棉花或滤纸过滤（目的：滤除菌丝，并使孢子分散度大于95）调整孢悬液浓度（真菌：106107/mL；放线菌：107108/mL）,诱变育种原则之四,选用合适的诱变剂量剂量表示方法紫外线：照射强度与作用时间之乘积化学诱变剂：诱变剂浓度与处理时间相对剂量：杀菌率,紫外线剂量单位,尔格/s.cm2以E.coliT2噬菌体的致死率表示E.coliT2噬菌体的致死率与紫外线的剂量呈直线关系：200尔格/s.cm2时，E.coliT2噬菌体的致死率为99；3600尔格/s.cm2时，E.coliT2噬菌体的致死率为99.99相对剂量；用致死率和照射时间（或距离）两个参数的综合值距离在1/3灯管长度范围内，强度与距离成反比；距离在1/3灯管长度范围外，强度与距离的平方成反比；,诱变育种剂量选择的两条重要实验曲线,剂量存活率曲线：剂量为横坐标、细胞存活数的对数为纵坐标剂量诱变率曲线：剂量为横坐标、诱变后获得的突变细胞数为纵坐标,诱变育种原则之五,充分利用复合处理的协同效应,诱变育种原则之六,利用、创造形态、生理与产量之间的相关指标简便快筛方法水解圈：蛋白酶、纤维素酶变色圈：淀粉酶、柠檬酸显色圈：氨基酸抑菌圈：抗生素指示菌生长圈沉淀反应圈：细菌外毒素,诱变育种原则之七,设计高效筛选方案初筛：以量为主，选留较多有生产潜力的菌株复筛：以质为主，对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定,菌种筛选方案,突变株的筛选方法,产量突变株的筛选方法抗性突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法,抗性突变株的筛选方法,梯度平板法药物临界致死浓度法纸碟法,抗性突变株的筛选流程,诱变筛选复证,营养缺陷型突变株的筛选方法,术语营养缺陷型突变株及表示方法野生型菌株及表示方法原养性菌株及表示方法基本培养基（MM）完全培养基（CM）补充培养基（SM）,营养缺陷型筛选方法,诱变淘汰野生型抗生素法；细菌青霉素、真菌制霉菌素菌丝过滤法检出缺陷型鉴定缺陷型（生长谱测定）,第三节基因重组和杂交育种,基因重组（遗传重组）是指两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的、稳定的基因组的过程。,微生物中基因重组的形式,涉及到整套染色体的基因重组：涉及到部分染色体的基因重组涉及到个别或少数基因的重组P224表710,原核微生物的基因重组,重组形式：转化、转导、接合、原生质体融合特点：,转化,定义：受体菌直接吸收来自供体菌DNA片断而获得供体菌部分遗传形状的现象。转化子：转化以后的受体菌转化因子：来自于供体菌DNA片断,能进行转化的微生物,影响转化的因素,感受态：是指受体菌最易接受外来DNA片断的生理状态。影响感受态出现的因素：遗传控制所处的生长阶段外界因素：cAMP、钙离子感受态因子,转染,专指用提纯的病毒核酸（RNA、DNA）去感染其宿主细胞或原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,转导：是以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，是受体菌获得新的性状。转导子：转导以后的受体菌。能够进行转导的微生物：,转导(transduction),转导的类型,根据转导基因片段的范围，可将转导分为两类：普遍性转导：转导的DNA可是供菌染色体上的任何部分局限性转导：转导的DNA只限供菌染色体上的特定基因,普遍转导（generalizedtransduction）,噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导,完全普通转导示意图,转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，在选择培养基平板上形成微小菌落,流产普通转导,局限转导,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,局限转导,局限性转导(restrictedtransduction),温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因,低频转导,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,局限转导子（极少量）,低感染复数,高频转导,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,三次感染，三次整合，一次切割，两次复制，两次裂解，两次转导,高感染复数,双重溶源菌,缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制,高频转导裂解物,部分缺陷噬菌（局限转导噬菌体）,正常噬菌体,等量,转导颗粒,局限转导子（大量）,低感染复数,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,4.溶原性转换(lysogenicconversion),当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了噬菌体的DNA片段，使其成为溶原状态时，而使细菌获得新的性状。,溶源转变是一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。,溶源转变的特点：1、噬菌体不携带任何供体菌的基因；2、噬菌体是完整的，而不是缺陷的；3、噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿主获得新性状，无通过基因重组而形成的稳定转导子；4、宿主获得新性状具有不稳定性,接合(conjugation),接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接