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学生：王薇指导教师：李槿年教授,细菌基因缺失株的构建方法,1,汇报提纲,基本概念,1.,2,一、基本概念,基因的同源重组（homologousrecombination），又叫基因打靶（genetargeting），是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定的位置上，从而改变了细胞某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因。,3,二、Red重组系统介绍,4,1、背景,二、Red重组系统介绍,敲除细菌基因的传统方法是利用RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系，它由RecA蛋白和RecBCD蛋白组成。这种方法需要较长的靶基因同源序列，还需构建具有靶位点的质粒，重组效率较低。近来由Murphy和Stewart等人用噬菌体的Red重组系统在大肠杆菌中建立的快速敲除原核基因的方法简化了实验操作，使实验周期大大缩短。这种重组技术是一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。,5,2、组成,二、Red重组系统介绍,质粒pKD46：为同源重组的辅助质粒，含温度敏感型复制子，高于37该质粒会丢失，阿拉伯糖诱导后能够表达Gam、Beta和Exo3个噬菌体重组酶。,6,2、组成,二、Red重组系统介绍,质粒pKD3：为PCR扩增提供氯霉素抗性基因的模板，氯霉素抗性基因两侧有FRT位点(FLP重组酶识别位点)，为重组转化子提供筛选标志。,7,2、组成,二、Red重组系统介绍,质粒pCP20：是具有氨苄青霉素(Amp)抗性和氯霉素(Cm)抗性的质粒，含有温度敏感型复制子，能够表达FLP重组酶，42诱导下FLP重组酶得到表达，质粒也逐渐丢失，该质粒用于消除FRT位点间的cat基因。,8,3、原理,二、Red重组系统介绍,HX4,HX4,HX4,HX4,HX4,HX4,9,4、利弊,二、Red重组系统介绍,以Red重组系统为基础的基因敲除是最近研究较热的技术方法，对研究微生物基因的功能具有重要的促进作用。它与传统的基因敲除方法相比，重组效率明显提高，而且此方法利用线性打靶DNA，不需构建打靶质粒，因此实验周期大大缩短。但到目前为止，此系统还主要应用于大肠杆菌的基因整合和敲除，在其它菌株获得成功的实例较少，具体原因尚不明确。,10,三、重组自杀性质粒方法简介,11,三、自杀质粒方法介绍,1、简介,12,三、重组自杀性质粒方法简介,2、原理,13,三、重组自杀性质粒方法简介,2、原理,14,2、原理,三、重组自杀性质粒方法简介,15,OmpU,OmpU,OmpU,pSKOm
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