免疫固定电泳操作规程

免疫固定电泳操作规程一.项目名称水凝胶免疫固定二。检验方法名称琼脂糖凝胶免疫固定电泳三。方法原则血清蛋白电泳的异常条带主要存在于-球蛋白和-球蛋白区，这两个区通常被怀疑是单克隆蛋白，提示有丙种球蛋白血症。免疫固定技术可用于识别异常条带。免疫固定电泳是一种简单的技术。电泳后的蛋白质与相应的抗体形成复合物，并固定在相应的位置。采用以下四个步骤：1.琼脂糖凝胶中蛋白质的电泳分离。2.电泳后，分离的蛋白质被固定并发生免疫沉淀：将固定剂和抗血清施加到凝胶表面的泳道上，并允许固定剂和抗血清在凝胶中渗透和扩散。3.用吸水纸和洗涤剂去除未沉淀的蛋白质，沉淀的蛋白质储存在凝胶中。4.对蛋白质进行染色，并将这些免疫沉淀区的位置与蛋白质电泳后观察到的异常蛋白质区进行比较。为了准确识别单克隆区，同时在六个泳道上测试样品。电泳后，使用ELP作为参考泳道来显示电泳后的蛋白质。剩余的五条泳道用于鉴定单克隆成分。可以确定它是否与抗血清、(IgG)、(IgA)、(IgM)重链和、轻链(自由和非自由)反应。这种技术简单、快速、清晰且易于解释结果。四.方法的可追溯性自从1930年Tiselius发现移动边界效应以来，这种技术的各种局限性已经被区域电泳逐渐克服。区域电泳的条件和支持介质的选择是电泳成功的关键。用免疫化学方法观察其电泳和抗原特性是鉴定蛋白质组分的最佳方法，而免疫固定电泳是目前应用最广泛的方法之一。V.工具(I)型号：SEBIA HYDRASYS(零件号1210)(2)分析计算参数：1.吞吐量：大约18个样品/小时2.所需样本量：10微升3.检查时间：约55分钟4.重复性：良好的批内和批间重复性5.电泳参数：电压0-300伏(可选至3000伏)电流0-500 ma功率0-100瓦六.试剂和支持产品(1)试剂1.hydragel 1if套件HYDRAGEL 2中频套件HYDRAGEL 4中频套件HYDRAGEL 9中频套件(1)商标：SEBIA(2)包装规格：10次测试/20次测试/40次测试/90次测试(3)编号：PN4301/PN4302/PN4304/PN43092.脱色溶液(1)商标：SEBIA(2)包装规格：10100毫升包装(3)编号：PN4540(4)成分：柠檬酸3.清洗液(1)商标：SEBIA(2)包装规格：1080毫升包装(3)号码：PN4541(4)成分：叠氮化钠4.稀释液(1)商标：SEBIA(2)包装规格：15毫升包装(3)编号：PN4587(2)配套产品：中频试剂抗体(1)商标：SEBIA(2)包装规格：51毫升包装(3) PN4315七.操作步骤(一)启动机器并启动电泳设备。(ii)在整个表面放置1个(1，2IF)、2个(4IF)或3个(9IF)取样梳，编号端朝上，在2分钟内完成每个取样梳的取样，在每个孔中加入10ul样品，然后将取样梳向上放入湿盒中5分钟。电泳/免疫固定泳道孔号ELPGAMKLHydrasys 1中频123456Hydrasys 2/4中频样本1或3234567样本号2或491011121314Hydrasys 9中频样本1、4或7123456样本号2、5或8789101112样本号3、6或9131415161718(iii)选择相应的“如果”电泳程序，(iv)从包装袋中取出缓冲条，将其固定在电极架背面的钉子上，然后取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻吸去凝胶表面的多余液体，向温控板表面的下1/3处加入200微升蒸馏水或去离子水，将凝胶片的底边靠近框架的底边。 将边缘与侧线对齐，慢慢压平稍微弯曲的凝胶片，并注意凝胶片下没有气泡。(五)自然放下支架，从湿箱中取出加样梳，取下齿梳下的保护支架。1号和2IF的加样梳放在支架的6号位置，4IF的2个加样梳分别放在3号和9号位置，9IF的3个加样梳分别放在2号、6号和10号位置。请注意，加样梳上的数字必须面向操作者，关闭电泳室盖，按下键盘左侧的绿色箭头“开始”键，电泳开始，以确保仪器右侧的空气通道没有堵塞。(六)电泳仪自动发出蜂鸣声，指示电泳结束，并进行免疫固定操作。打开电泳盖，丢弃加样梳和缓冲条，取下两个支架，用湿纸巾擦拭电极线，将抗体添加样条装在抗体添加架上，按照以下要求将动物血清抗体添加到抗体添加样条上：Hydrasys 1 IF使用6孔抗体加样条：加每孔8l抗体。Hydrasys 2/4IF使用15孔抗体加样条333，602人份加每孔8l抗体，4人份加每孔12l抗体Hydrasys 9 IF使用18孔抗体加样条：加每孔8l抗体。固定抗体装载架，并将抗体添加到凝胶片中。然后关闭电泳舱门，按“开始”键开始免疫固定。(VII)10分钟后，电泳仪自动发出哔哔声并提示“吸纸”。取下抗体样品装载架，丢弃抗体样品装载架，将一张厚滤纸放在凝胶表面，滤纸的光面朝下，用左手固定滤纸，用右手的手指摩擦滤纸表面，注意不要移动滤纸，关闭电泳室盖，按“开始”键开始吸收凝胶表面多余的抗体。(VIII)3分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳室盖，取出滤纸，关闭室盖，并按下“开始”键开始干燥凝胶片。(IX)6分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳室盖，取出凝胶片，用湿纸巾擦拭温控板，将薄膜固定在凝胶支架上并放入染色空间。检查洗涤液瓶内是否有400毫升洗涤液，染液瓶内是否有300毫升染液，脱色液瓶内是否有1000毫升脱色液，废液瓶是否排空后，选择菜单上的染色说明，按“开始”键开始染色。(x)染色、脱色和干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶架，取下干燥的薄膜。八.临床意义这对多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、分泌性骨髓瘤、轻链疾病和重链疾病的研究具有重要意义。1.正常人体内存在正常的免疫球蛋白分布，免疫固定电泳图谱中可见分布均匀的免疫球蛋白/抗原/抗原2.在IgG/A/M、和lammda泳道上发现的浓缩条带是病理性的。九.样本要求(一)取新鲜血清进行分析，根据临床实验室用于各种试验的操作程序采集血清样本。样品可在冰箱(2 8)中保存一周，冷冻保存时间可延长至少一个月。向冷冻血清样品中添加0.02克/分升叠氮化钠可提高其储存稳定性。(ii)为了避免因抗原过量而导致的条带化，在添加样品之前，应按照如下方法稀释血清并混合均匀。泳道血清(ul)稀释剂(ul)蛋白质电泳(ELP)和其他免疫球蛋白固定泳道3060IgG免疫固定泳道20100特殊情况当总免疫球蛋白水平 20 g/l时，稀释剂量加倍(除了泳道ELP)当总免疫球蛋白水平5g/l时，稀释剂量减半(除了泳道ELP)冷藏或冷冻后，一些样品(尤其是含有冷冻球蛋白或冷冻凝胶的样品)可能变得粘稠或混浊。由于扩散障碍，这种样品可能存在取样问题。在这种情况下，将25微升液化剂加入到75毫