生物制药工艺学-多肽与蛋白质类.ppt

多肽与蛋白质类药物,第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法一、蛋白质类药物的分离与纯化（一）材料的选择蛋白质类药物的来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的，易于提取得无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为了提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属，发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定要求，使得纯化工作相对容易。,天马行空官方博客：,（二）蛋白质提纯的一般方法1.根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。等电点沉淀等电点除杂,2.根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。由此可以用凝胶过滤法，超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。3.根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。4.根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。,对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力。5.根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。主要手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。固相化金属亲和层析IMAC是新发展的一种亲和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素（如Cu2+,Zn2+)形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。,6.根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。7.根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质逆流分配色谱8.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。,9.根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。10.根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质SOD酶抗蛋白水解酶。（三）蛋白质的分离与纯化1.时间因素2.选择离子交换层析条件的程序3.蛋白质分离纯化的可能的技术组合。,（四）溶液中蛋白质浓度的测定1.紫外法（1）280nm光吸收法1mg/mlA280为1.0（2）280nm和260nm的吸收差法mg/ml=1.45A280-0.74A260（3）215nm和225nm的吸收差法Mg/ml=0.144(A215-A225)2.双缩脲法3.福林酚试剂法4.考马斯亮兰G250染色法,天马行空官方博客：,（五）纯度检查1.HPLC2.电泳法3.免疫化学法4.生物检测法5.分光光度法二、多肽与蛋白质的化学合成多肽合成是50年代开始获得重大发展的。1965年中国科学家在世界上首次合成了胰岛素。（诺贝尔奖）1962年建立了固相合成新方法。,多肽合成的一般步骤：1)氨基保护和羧基活化；2)羧基保护和氨基活化；3)接肽和除去保护基团。（一）基团保护要实现控制多肽合成，必须做到事先把不应与接肽反应试剂发生作用的官能团，如N末端氨基酸残基的自由NH2，C末端氨基酸残基的自由COOH及侧链上的一些活泼基团，特别是巯基等，加以封闭或保护。待肽链形成以后，再将保护基团除去。应用最多的氨基保护剂是苄氧羰酰氯（CbzCl），它与氨基酸或肽上的游离氨基作用形成苄氧羰酰氨基酸（Cbz氨基酸）或Cbz肽。可用催化氢化法或钠氨法（用金属钠在液氨中处理）除去保护基，也可以用叔丁氧羰酰氯（BocCl）作保护剂，用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。羧基保护剂通常是用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使羧基上接上烷基。除去保护基可在室温下用氢氧化钠皂化法。,有些氨基酸除了含氨基和羧基外，还有其它功能基团，在合成肽时都需要用适当的保护基团加以保护。例如组氨酸的咪唑基，丝氨酸的羟基，酪氨酸的酚基，半胱氨酸的巯基，都可以用卞基（Bz）保护，用钠氨法除去。谷氨酸和天冬氨酸的和羧基可用苯甲酯保护，用催化氢化除去。精氨酸的胍基用对甲基磺酰氯（Tos）保护。（二）肽的液相合成法接肽反应除用缩合剂来完成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨基和羧基的方法来完成。因活化氨基地反应非常激烈，而且常常产生消旋化，所以，总是采用羧基活化的方法。肽的合成法可分为阶梯伸长法和片断缩合法。,天马行空官方博客：,1)阶梯伸长法DDC法（N，N二环已基碳二胺），首先使N端保护氨基酸同DDC反应，形成酐后，加入另一个氨酸，缩成肽。（R1CO)2R2-NH2R1-CO-NH-R2活化酯法，带有N保护基的氨基酸对硝基芳香族酯，能与另一个氨基酸酯的氨基缩合成肽。HGlyOMeZLeuOC6H4NO2ZLeuGlyOme2)片断缩合法常用叠氮法,肽的固相合成,（四）游离肽的获得分离纯化，真空干燥，冷冻干燥。第二节多肽类药物一、概述主要多肽类药物有以下几种：1、多肽激素（1）脑垂体多肽激素促皮质素（ACTH），促黑激素,催产素，加压素（2）下丘脑激素促甲状腺激素释放激素，生长素抑制激素，促性腺激素释放激素（3）甲状腺激素甲状旁腺激素，降钙素（4）胰岛激素胰高血糖素，胰解痉多肽（5）胃肠道激素胃泌素，胆囊收缩素，肠泌素，肠血管活性肽，抑胃肽，缓激肽，P物质,（6）胸腺激素胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子2、多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子，转移因子，心钠素3、含有多肽成分的其它物质二、主要多肽类药物的制备1、胸腺素（thymocin）牛胸腺素5（1）结构和性质胸腺素组分5是由80热稳定的40-50种多肽组成的混合物，分子量在100015000之间，等电点在3.59.5之间。胸腺素组分5中，胸腺1、5、7、3、4等具有调节胸腺以来淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分。连续诱导T细胞分化发育的各个阶段，放大并增强成熟T细胞对抗原或其他刺激物的反应，维持机体的免疫平衡。,（2）生产工艺,胸腺,绞碎,胸腺碎块,生理盐水提取,提取液（组分1）,加热，去杂蛋白,80，15min,上清夜（组分2）,丙酮,沉淀10,丙酮粉（组分3）,pH7.0硫酸铵0.25饱和度,上清夜（组分4）,硫酸铵0.5饱和度,pH4.0,盐析物,超滤,pH8.0TrisHCl,超滤液,SephadexG25,脱盐，干燥,胸腺素（组分5）,作用与用途：作为免疫调节剂原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等；自身免疫病，如肝炎，肾病，红斑狼疮，类风湿关节炎、重症肌无力等；变态反应性疾病，如支气管哮喘等；细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老。肿瘤的辅助治疗。,第三节蛋白质类药物主要蛋白质类药物有以下几种：1.蛋白质激素（1）垂体蛋白激素生长素，催乳素，促甲状腺素，促黄体生成激素，促卵泡激素（2）促性腺激素人绒毛膜促性腺激素，绝经尿促性腺激素，血清促性腺激素（3）胰岛素及其它激素2.血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血纤蛋白等3.蛋白质类细胞生长调节因子干扰素等,4.粘蛋白胃膜素，硫酸糖肽，内在因子5.胶原蛋白明胶，阿胶6.碱性蛋白硫酸鱼精蛋白7.蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂8.植物凝集素PHA，ConA,二、主要蛋白质类药物的制备（二）干扰素(interferon,IFN)1.结构和性质干扰素系指由干扰素诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。有型、型和型及许多亚型。2.生产工艺,人白细胞,启动诱生人干扰素,37，12h,启动白细胞,正式诱生仙台病毒,37，12h,白细胞培养物,离心分离,2500rpm,粗制干扰素,KSCN处理HCl,pH3.5,沉淀1,乙醇除杂,5,上清液1,二次酸除杂蛋白HCl,pH5.55.8,上清液2,沉淀分离NaOH,pH8.0,沉淀2,KSCN处理PBS，,pH5.2,上清液3,酸沉淀HCl,pH3.0,沉淀3,溶解PBS，NaOH,pH7.07.5,溶解液,透析,透析液,干扰素,工艺过程：1）分离灰黄层取献血者血液（每份400ml）采入含抗凝血剂的塑料袋内，离心后分出血浆，小心吸取黄灰层，每份血可吸13-15ml，约为血中细胞的40-50，放置4冰箱过夜。2）氯化铵处理每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，在加入总体积9倍量的0.83的氯化铵溶液，混匀，4放置10min。然后离心20min，收集沉淀细胞，做成悬浮液，再用氯化铵处理一次，融解残存的红细胞。取沉淀的白细胞并悬浮于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温培养液稀释成107个/ml。培养液的基础成分为Eagles培养基。,3）起动诱生取稀释的细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100/ml,置37水浴搅拌培养。4）正式诱生起动后的白细胞加入仙台病毒，使其