两大蛋白质染色主流方法大比较

两种主要蛋白质染色主流方法的大比较日期：2012-05-31来源：未知标签：komas亮蓝银染色蛋白染色摘要：中常用的蛋白质染色试剂分为科马斯布瑞林蓝代表的有机试剂染色、银染色、荧光染色和同位素着色。其中，科普斯亮蓝染色法被广泛使用，与其他蛋白质染色法(主要是银染色法)比较，可以更好地选择合适的蛋白质染色法。蛋白质染色通常有四种：有机试剂染色、银染色、荧光染色和同位素着色。有机试剂染色成考马斯亮蓝。汉常数生物-伦蒂病毒腺病毒免费测试应用入口汉常数生物-线相关病毒(动物体内转染装置)免费测试应用程序入口新一轮恩菲美生物试剂2-5%减价！常用的蛋白质染色试剂分为科马斯布瑞林蓝代表的有机试剂染色、银染色、荧光染色和同位素着色。其中，科普斯亮蓝染色法被广泛使用，与其他蛋白质染色法(主要是银染色法)比较，可以更好地选择合适的蛋白质染色法。蛋白质染色通常有四种：有机试剂染色、银染色、荧光染色和同位素着色。其中有机试剂染色代表考马斯亮蓝染色法(CBB)，在蛋白质分析中常用，但丰富的蛋白质看不清。银染色灵敏度高，但经常与质谱不兼容。荧光染色以SYPRO试剂为基础，蛋白质检测灵敏度高，与质谱相兼容，但由于需要配备特殊的检测仪器和试剂，因此不作为常规方法使用。同位素颜色显示安全和操作限制及其他问题。因此，审查简单、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究的必要条件。随着科普斯亮蓝染色法的广泛使用，近年来，在提高对科普斯亮蓝染色法敏感性的过程中，研究者们被评价为通过多种方法进行了改进。做二维凝胶电泳时，我们比较了几种常用的科马氏亮蓝染色法和银染法，并分析了其染色的影响因素。试剂固相pH渐变干带(IPG strip pH3-10NL、IPG strip pH5-8、17厘米)，urea，CHAPS，TBP，DTT，Bio-Lyte 3/10硫酸铵和磷酸是在成都科龙试剂厂购买的。AgNO3是由sigmasa制作的。Protein molecular marker # sw0431由MBI制作。甲醛、Na2S2O3和Na2CO3分别是成都天华技术有限公司、重庆北北化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化学厂产品。仪器像IPGphor这样的电气集中器、proTEAN垂直电泳、Power PAC1000电泳、样品充气罐、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件都是Bio-Rad公司的产品细胞总蛋白提取定期培养的4个急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4)1107细胞，分别为350 l蛋白质分解缓冲液(8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier ampholytty)单向定量电泳用1: 2首次稀释蛋白质分子质量标准物后，按1: 3的比例逐步稀释，然后稀释到4级，将15l上液和-galactosidase上等量分别变为1g、0.24g、0.062g、0.0156g、0.004g12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，4种胶为电泳，颜色决定染色灵敏度。双向电泳从左到右线性添加300l样品溶液，使17厘米IPG胶带朝下，45分钟后复盖矿物油，在20 膨胀11 16小时。将膨胀磁带放在等电聚焦板上，在Protean IEF Cell中设置等电聚焦，温度为20 ，电压模式为250 V，0.5小时。500 V，0.5小时，10000 V，60000 Vh(伏特时间)。IEF的IPG条为DTT平衡溶液1(6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L)和碘乙酰胺平衡溶液2将平衡的IPG条放在预先移植的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶中密封，15 低温水循环条件下15 ma/凝胶电泳15分钟后25mA/gel恒流电泳。发色取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶，用超纯水清洗2次，每分钟4次，用不同的染色方法着色4种胶水。以下每个步骤都在着色器中执行。4种染色方法成分和操作如下。传统的考马斯亮蓝染色法：清洁用凝胶用固定液(45.4%甲醇，4.6%乙酸)固定1小时，然后用染液(45.4%甲醇，4.6%乙酸，0.1% CBB G250)通宵上色colloidal COO massie brilliant blue，cCBB)染色法：凝胶经过超纯水冲洗后，colloidal Coomassie blue G250染液(1.6%磷酸，8%硫酸铵，0.02改性考马斯亮蓝(mCBB)染色法6；与胶体考马斯亮蓝染色法相同，但只需染色液成分(0.12% CBB G250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%乙醇)着色1小时即可。银染：凝胶冲洗后1小时内固定液(50%甲醇5%乙酸)固定，此后分别用50%甲醇和超纯水清洗10分钟，0.02毫克/L Na2S2O3致敏1分钟成像、分析、质量分析识别脱色后，凝胶经过GS-800 Calibrated Densitometer扫描图像，分析为PDQuest软件。切断蛋白质点，消化胰蛋白酶，确认质谱。结果4种染色方法的蛋白质检测灵敏度分析-半乳糖苷酶的相母分别为1，0.24，0.062，0.0156，0.004g。在通科马斯亮蓝染色后，条纹在62ng水平上隐约可见。胶体科马什亮蓝染色法灵敏度稍高，62ng波段引人注目。改进comas亮蓝染色法，可以在15.6ng水平看到条带显示。银染色法灵敏度最高，清晰的条带在15.6ng水平上可见，在4ng上隐约可见。比较4种染色方法，灵敏度最高的是银染色法，可以检测到纳克级水平，其次是改良科马斯布林蓝染色法，可以检测出10纳克级蛋白质。科洛伊科马什布莱恩特蓝染色法和古典科马什布莱恩特蓝染色法只有几十克。4种染色方法的双向电泳蛋白质点显示比较来自NB4细胞的蛋白质以pH 3-10NL的等电点梯度分离，SDS-PAGE双向垂直电泳后3种染色法着色的影像显示，现有的考马氏亮蓝染色法的蛋白质点最少，胶体科马氏亮蓝染色法的蛋白质点更多，改良考马氏亮蓝染色法的蛋白质点更多。凝胶背景后，两者都更加清晰。PDQuest软件分析后，三个图的蛋白质点标记分别为483、679和890。NB4细胞的全部蛋白质由pH 5-8 IPG分离，分别用改良的考马斯亮蓝染色法和银染法标记着色蛋白质点，两者以相似的量出现蛋白质点，但银染的蛋白质点明显表示着色重量。这是单向电泳的效果。4种染色方法的可操作性比较在比较蛋白质检测敏感性的同时，还比较了染色的操作简便性、安全性、质谱鉴定蛋白质的成功率。komas亮蓝色染色很容易，但需要很长时间，并且改进了执行无毒工作，质量分析兼容性更好。银染阶段很多，但需要很多时间。操作过程中接触了甲醇、甲醛等有毒物质，质量分析兼容性较低。即使报道我们选择的银染法与质谱兼容，但仍显示出低于komas亮蓝色的蛋白质识别率。讨论凝胶染色对蛋白质分辨率的影响二维凝胶电泳分辨率的提高是蛋白质组学研究要解决的课题和技术发展方向，其中影响蛋白质分辨率的因素很多，其中凝胶染色法对蛋白质分辨率的影响不容忽视，影响实验图像结果，直接干预后续质谱。目前在蛋白质组学领域广泛使用的有考马斯亮蓝染色法和银染法两种。化学名称CBB G-250，结合二甲戊灵蓝、部分酸性、蛋白质碱基组，从黄褐色变成深蓝色。科普斯亮蓝染色法可达到微克级检测水平，着色程度与蛋白质量的线性力学广泛相关，适合定量分析。该方法成本低，使用方便，与下游质谱鉴定技术兼容，应用非常广泛。但是由于微克级的检测水平，相当多的低丰度蛋白质泄漏，蛋白质学越来越成为瓶颈现象，提高染色灵敏度的研究和各种染液的搭配和方法出现了，文献报道的很多方法受到了评价。现有考马斯亮蓝染色法的灵敏度达数百纳米克，胶体考马斯亮蓝染色法可检测数十纳克的蛋白质，选择了3种常用考马斯亮蓝染色法，根据改良考马斯亮蓝染色法可测量到几纳克的蛋白质水平。改善考马斯亮蓝染色法，蛋白质检测灵敏度高，甚至可以与银染色相媲美。银染色法利用银离子和氨基酸共享价格添加还原剂，与胶内蛋白质结合的银离子形成金属银，使其看起来呈现货色。有关1 ng以下蛋白质的文献报道，其灵敏度比现有的考马斯亮蓝染色法高约100倍，广泛用于蛋白质组学研究，但银染阶段复杂繁琐，着色线性动力学复盖范围小，引起蛋白质差异标记的不准确，同时，由于游离银离子及相关试剂的存在，在后续分析和识别方面存在一些实际困难。我们的实验只使用了一种银染色法，结果表明银染色法的敏感性高于所有的comas bliant蓝染色法，4 ng的蛋白质带也可以暴露出来，但蛋白质识别成功率较低。蛋白质检测灵敏度的影响因素蛋白质着色的敏感性不仅与上述分析内容有关，还与染色过程中涉及的有机溶剂和离子有关。科马什亮蓝染色法和银染色法使用有机溶剂，例如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛。甲醇和乙醇对染色起固定作用，将蛋白质固定或阻断到凝胶中，扩散到凝胶中。同时还去除去势剂、还原剂、缓冲液等妨碍电泳过程中残留的染色过程的物质。醋酸的作用在蛋白质固定的同时，保持染液的酸度，有助于考马斯亮蓝和蛋白质的结合。他们的存在有利于获得背景干净、信噪比高的图像。在有机溶剂的三种类似作用下，我们将乙醇保持在集落斯亮蓝染色法和改良集落斯布伦蓝染色法中唯一的固定洗涤剂，用磷酸代替乙酸酸化，以两种集落斯亮蓝染色法获得的视频背景比传统集落斯亮蓝染色法更清晰，带更尖锐。在胶体考马斯亮蓝染色法中，在酸性乙醇介质中添加硫酸铵，着色剂形成胶体染色粒子，粘合剂本身不显着色，蛋白质染色灵敏度增加。在改进的科马什亮蓝染色法中，高酸、高离子环境下蛋白质的葡萄糖胺和天冬氨酸色素更适合与染色剂结合。因此，两种染色方法显示了背景明亮、检测出大量蛋白质的图像，在改进的komas brilian blue染色方法中，高山、高离子存在，灵敏度高，接近银盐水平。甲醛在银染色中起到还原剂的作用，还原结合蛋白质的银，使其发色。甲醛浓度影响染色效果，浓度一般为400 500 l/l。甲醛浓度高，橡胶颜色变黄，背景颜色混杂，很难发现目的点。浓度低，不仅染色时间长，着色也不容易。银的络合剂硫代硫酸钠防止游离银离子还原为金属银，减少非特异性染色，减少背景染色，其浓度一般为0.1 0.2mg/l。络合剂的量太大，粘合剂颜色太深。少的话，玻璃银离子螯合不足，胶颜色黑。质谱仪兼容性的影响因素comas bliant blue G-250在一定pH下完全降解这种染料-蛋白复合物。适应蛋白质质谱；银染中使用的银离子和醛会引起肽之间的相互联系，影响口香糖内蛋白质的酶水解和溶出，降低蛋白质质谱中氨基酸序列的应用范围，使komas Lian蓝染色蛋白质识别成功率在60% 80%之间，远远高于银染确认成功率(30% 60%)。结果前者的质谱成功率只有50%，后者只有5%。考虑到这一点，还在不断寻找提高银染成功率的新方案。操作的安全性和简单性由于有机溶剂的类似作用，我们在改进后的comas bliant blue染色中丢弃有毒甲醇和难闻气味的乙酸，同时，逐步利用染色和一步固定减少一步固定，仅用超纯水洗涤就缩短了整个染色和人