PCR扩增原理及过程1PPT课件

第8章：PCR技术和应用，PCR技术是模拟身体DNA复制的方法，是在体外特定区域选择性扩增DNA的技术。这个过程和一般的DNA复制一样，包含三个步骤。第一种是模板DNA变性，从双股状态到单股状态；然后，将底漆和模板组合在一起，以完成复制过程。最后，在DNA聚合酶和基质存在的情况下，合成了互补模板的DNA。第一节PCR技术原理和工作原理，第一节PCR的基本原理1，基本要素和扩增原理DNA的克隆是生命活动最基本的过程之一，PCR的基本原理离不开DNA克隆的基本规律。在PCR过程中，模板可以是双股DNA或单股DNA，最终会以双股状态放大。在这里，引物在DNA复制中是不可缺少的。与简单的DNA复制不同，PCR扩增总是在两个引物的存在下同时复制两条DNA，并从复制结果中获得一条双链DNA。装置的自动控制使这种DNA复制重复，从而获得位于两个引物之间的大量DNA片段目的片段。从先前扩增中获得的DNA产物可以形成几何增长的下一扩增的模板。2，PCR扩增的阶段首先将模板DNA放置在9296度进行变质处理，将双链DNA从高温分解为单链DNA，此时的温度称为解链温度Tm，热变性不改变其化学性质；染色后退火，将温度降低到3772度，将底漆和模板的互补性结合起来，最后在72度条件下，DNA聚合酶将dNTP连续合成底漆3 hydroxyend的阶段称为延长。这三种热反应过程的重复性称为一个循环，20到40个循环可以在两个引物序列之间放大大量的DNA片段。melting temperature(Tm):50% DNA:DNA分子变质时的温度50%，称为熔体温度/衰变温度。在一般生理条件下，Tm在85 95之间。影响Tm值的因素：(G C)含量增加，Tm值溶液离子强度提高，Tm增加(离子键的形成增加)；甲醛浓度增加，Tm减少(使碱基对之间的氢键不稳定，从而避免高温变性时g，c含量高的DNA断裂，停用)。如果DNA比较单一，变性发生在狭窄的温度范围内。第二，PCR反应系统，PCR反应只在一定条件下进行。只有在这些条件协调的时候才能取得好的效果。1、缓冲液2、脱氧核糖核酸(dntp)3、引物4、模板5、DNA聚合酶、1，缓冲液：除了提供缓冲液ph缓冲液外，还有几个辅助反应进行成分，主要包括Mg2。Mg2浓度的高低影响放大的特异性和产率，直接影响放大的成败，最佳镁离子浓度取决于引物对和模板。为了确定最佳浓度，以增加0.1-5mmol/L的浓度Mg2为初步实验，选择最佳Mg2浓度。2，脱氧核糖核酸(dNTP)是DNA合成的基质，高浓度dNTP容易混合误差；但是浓度太低，反应产物的产量就会减少。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度必须相同，如果其中一种浓度与另一种浓度(高或低)明显不同，则会导致聚合酶的错误混合，合成速度减少，扩展反应过早终止。PCR中常用的dNTP，3，模板模板是要复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是PCR的核心，模板质量是PCR成功的前提，一般建议使用纯度高、精制过的DNA样本(粗制产品必须避免蛋白酶、核酸酶混合)。此外，模板数会直接影响放大效果。一般要求适当，3105分子数(1g)(产量增加，非特异性放大减少)；4、DNA聚合酶用于PCR反应的DNA聚合酶处于高温状态，在90度以上的高温下仍然处于活动状态。PCR技术的激活就是利用高温DNA聚合酶。选择聚合酶应该从实验的特定要求开始考虑，高保真比较昂贵，只有要求条件严格的时候才选择。，TaqDNA聚合酶缺乏3 到5 外樱桃酶(补偿)活性，但产量高，被评价为目前实验室中使用最多的酶-低保真聚合酶。使用具有3 5外节体核酸酶活性的热稳定聚合酶，可以提高保真度。但是这种聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。(1)TaqDNA聚合酶是目前实验室PCR中使用最多的酶。5 到3 合成活性和5 到3 外体酶活性，但3 到5 外体酶活性不存在。95度的半衰期是40分钟。没有3 到5 外体酶活性，扩增范围为8.910-5 1.110-4的失序率。(2)TthDNA聚合酶可以在高温性细菌HB8在74度扩增Mg存在的条件下以DNA为模板合成DNA，在Mncl2存在的情况下以RNA为模板合成cDNA。(3)bent DNA聚合酶(4)pwoDNA聚合酶更多地使用3到5外切酶活性，高保真PCR酶(5)pfuDNA聚合酶是目前最常用的3到5外切酶活性的PCR酶商用混合酶，本课我们将阐述了PCR反应的工作原理。模板DNA、引物和dNTP存在下依赖DNA聚合酶的酶反应。将双股DNA转变成单股DNA的一对引物参数，单股DNA能使引物和复性(退火)成为引物DNA单股复合物，在dNTP存在中，DNA聚合酶能使引物沿着单股模板延伸到双股DNA(引物的延伸)。这种热变性-复性-扩张过程是PCR循环。2 .循环次数越多越好吗？为什么？显然不是。任何一个都必须有度。一般周期在25 30次之间后，周期数进一步增加，不一定意味着产品数量增加。这是因为PCR扩增过程中后期出现平台效应，如果在此期间产品积累减少的指数速度增加，底物和引物浓度降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，结果pyrophosphate抑制末端产品，非特异性产品或引物的二聚积累，非特异性竞争，扩增产品的自复性，高浓度扩增产物的不变性等几个不利因素PCR引物设计应注意的原则是什么？(1)长度：16-30bp，引物对。太短-非特异性放大，抑制竞争和特定放大，降低放大的敏感性；长-稳定的离合器或链条内容易形成互补，引物的扩展温度超过Taq酶的最佳温度，同时也增加了检测成本。(2)G C含量：占40-60%，Tm值大于55C。GC含量太低，引物Tm值降低，使用低退火温度不利于提高PCR的特异性。GC含量过高容易发生非特异性扩增。(3)碱基的随机分布