MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用

MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用，2，1，传统细菌检测方法及其缺陷，3，传统细菌检测方法及其缺陷，经典方法的初步分类：菌落形态，显微检测，以及革兰染色，氧化酶和接触酶等倾向测试。属或种的鉴定：基于细菌的生长和代谢过程的特征性生理生化反应，培养基的生长选择。缺陷部分生化测试在几分钟内完成，但大部分繁育和培养的微生物标本通常需要24-48h左右才能收到完整的确认报告，而部分毒菌或生长缓慢的细菌则需要更多的时间。操作麻烦，主观性强。4，现有细菌检测方法及其缺陷，分子生物学方法1。细菌核糖体(16SrRNA)基因序列分析：rRNA寡聚核苷酸序列是细胞内最稳定的序列，而不是DNA。细菌有三种rRNA，23S，16S，5S，16SrRNA是理想的细菌鉴定研究对象，因为其核苷酸数量适中，信息量大，稳定性高，提取和分析容易。分析细菌rRNA序列的相关性，确定细菌系统发育关系。5，现有细菌检测方法和缺陷，分子生物学方法2。其他：非九加细胞色素碱比率测定(G Cmol%)，核酸分子杂交实时荧光定量PCR缺陷：技术复杂性，高消耗，高假阳性率，无法自动化，高吞吐量。不适合临床常规检查！6，为了响应临床要求，迫切需要寻找病原微生物快速诊断的新方法7，现有细菌检测方法及其缺陷，2，矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱，8，(1)质谱的基本概念，9，质谱的基本概念，质谱学没有两个核素质量相同或一个核素质量完全不同的核素质量的整数倍。通过分析这些离子，可以获得化合物分子量、化学结构、分解规则等信息。10，原理：质谱仪，加速电场的作用，使离子束的每一组由电离离子产生。利用电场和磁场以相反的速度分布。在离子束中，速度较慢的离子通过电场，速度较快的偏转速度较慢的离子在磁场中发生更大的偏转，速度较快的偏转角度较小的磁场中发生质量分离，不同质量比的离子集中在不同的点上，可以分别得到质量分析表来确定其质量。11、质谱的基本概念，仪器：利用电场和磁场中偏转移动离子的原理设计的仪器，称为质谱仪或质谱仪。质谱是指用电子法检测离子，质谱是指离子聚焦在照相基板上检测。质谱计的仪器种类比较多。包括单焦点质量分析器、双焦点质量分析器和四极矩质量分析器。后两种被更多地使用，更多地用在气相色谱仪和电子计算机上。12、质谱的基本概念，高真空系统：质谱必须在高真空状态下工作。高真空阀泵系统通常由前电平泵(通常是机器泵)和油扩散泵或分子涡轮泵等组成。扩散泵可以将离子源保持在10-6-10-7毫米汞柱的真空度。分析器还有扩散泵，可以保持10-7-10-8毫米汞柱的真空度。13、质谱的基本概念、样品注入系统：可分为直接注入、气相色谱、液相色谱、气体扩散四种方法。固体样品通过直接注入条注入和加热样品，将固体样品转换成气体分子。用飞行或液相色谱预分离不纯样品，然后通过界面引入。液相色谱/质谱接口有皮带接口、直接液体接口和热喷涂接口。14、质谱的基本概念，离子源：电离样品以产生带电粒子(离子)光束的装置。最广泛使用的电离方法是电子轰击法(EI)。化学电离(CI)、光离子化、场电离、激光电离、火花电离、表面电离、x射线电离、场解吸电离、高速原子轰击电离。其中，场解吸和快速原子轰击特别适合于测定挥发性小、热不稳定的化合物。15、质谱的基本概念，质谱：根据质量-电荷比大小分离离子源形成的离子束的装置。单焦点、双焦点、四极矩、飞行时间(tof)、摆线等。16，质谱的基本概念，收集器：分析器分离的同质离子可以收集和检测照片背板、法拉第管或电子倍增器。质量分析器的分辨率和灵敏度等性能非常好，只要ug或ng级样品，就可以获得满意的质量分析图。对于微量不纯的化合物，可以使用气相色谱或液相色谱(极性较大的化合物)将化合物分离成单个成分，然后导入质谱计记录质谱计。17，质谱的基本概念，应用：色谱仪-与质谱-质谱相结合的结果给定信息量大，该方法与计算机相结合，可以在计算机上执行质谱的规范化、背景或热损失峰值的丢弃、由要素组成的给定、数据的存储和计算、多扫描数据的积累、未知化合物质谱的库检索、数据的打印和打印等任务，操作程序质谱尤其是与色谱仪和计算机相结合的方法，广泛应用于有机化学、生化、药物代谢、临床、毒理学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。18、质谱的基本概念、纯化、离子分离、分析、质谱：质谱有很多种，各种工具的应用特性不同。可在约300 汽化的样品可以优先分析为GC-MS。GC-MS是因为使用电子轰击法电离源(EI源)获得的质谱信息很多，并且可以进行库搜索。在大约300 下不能汽化，需要用LC-MS分析，这时主要获得分子量信息，对于串联质谱，还可以获得一些结构信息。如果是生物大分子，主要可以利用LC-MS和MALDI-TOF分析获取分子量信息。对于蛋白质样品，还可以测定氨基酸序列。19、质谱的基本概念，质谱：质谱的分辨率是重要的技术指标，高分辨率质谱能为结构测量提供非常重要的化合物组成。双焦点质量分析器、傅立叶变换质量分析器、带反射器的飞行时间质量分析器等都具有高分辨率功能。20，质谱的基本概念，21，质谱的基本概念-质谱，(2)矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱，22，1。MALDI-TOF-MS矩阵辅助激光解吸离子化飞行时间质谱是最近开发的质谱分析方法。的一部分。23，矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱，2 .主要概念矩阵-assisteddlaserdescriptionization(maldi)是直接气化和电离非挥发性生物样品的质谱方法。将分析对象溶液和任何基质溶液混合，蒸发溶剂，将分析对象物质制成基质和晶体或半结晶，然后用一定波长的脉冲激光照射，基质吸收激光能量，然后均匀地传递给分析对象物质，使分析对象物质瞬间气化和电离。使用矩阵的主要目的是保护被分析的物质，防止化合物被过量的激光能量破坏。24，矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱，2 .主要概念TOF(TimeOfFlight)，飞行时间分析器：相同的动能，不同的质量离子根据飞行速度分开。固定离子飞行距离，每个质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短，先到达探测器。25，矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱，3 .基本原理：在相加模板中，在溶剂挥发后形成样品和矩阵的共结晶矩阵从激光中吸收能量，解吸样品，由于矩阵和样品之间的电荷转移，根据样品分子电离到达飞行时间检测器的飞行时间进行检测。即，根据离子的质量比(M/Z)和离子的飞行时间成比例检测出的离子的分子量，通过特殊软件分析进行比较，确定了特定指纹，26，矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱，27，MALDI-TOF-MS电路图，矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱测量细菌自身的独特蛋白质成分，应用质谱方法，按照分子量大小排列测定的蛋白质和多肽，形成独特的蛋白质组指纹，通过特征模式峰识别菌株。29、MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用，(a)简单操作过程，1 .基质溶液配制2。样品的准备3。质量分析4。数据分析，30，maldi-tof-ms在临床微生物中的应用，制备基质溶液：4种常用基质。矩阵类型可能影响质量峰的形成。研究结果表明，以DHB50mg/mL，31，50%乙腈，0.1%三氟乙酸为基质检测液体培养细菌，可获得最佳的质谱。有可以购买的商用矩阵溶液。MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用，2 .准备样品(a)直接选择菌落汤(75%-90%)(b)乙醇/b清处理(10%-20%)临床标本接种于培养基(液体或固体)中，选择菌落或提取液体培养液，处理水和乙醇后，进行70%质谱将一定量的样品上清液点添加到目标板，干燥后放入等量矩阵(如CHCA等)，干燥后，马尔代托夫-ms分析脉冲激光、模式、加速电压、激光强度等因素尚未得到统一的模式，需要优化。33，MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用，Ekin=1/2mV2，4。数据分析通过软件处理质量分析图，进行主成分分析。*横坐标是质量电荷比(m/z)，纵坐标是吸收峰值强度(34，MALDI-TOF-MS)在临床微生物中的应用，35，MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用，简单的操作过程，简单的操作过程像Seng这样的研究表明，1066个分离细菌菌株代表109个不同的种类，84.1%被正确识别为物种，11.3%被确认为属。Bizzini等分析1371个临床分离体显示，93.2%在宗量5.3%中属于属水平。以识别种子的水为例，MS与传统生物化学方法的扁平匹配率为95.1%。在细菌检查中，37、MALDI-TOF-MS的应用范围，1、细菌菌种鉴定，利用与人类感染相关的37个属248种非发酵菌株建立数据库，测定80种临床分离菌株，并与16SrRNA基因序列分析进行比较。MS不能确认67例(85.9%)，9例，2例的身份。结论：MALDI-TOF-MS可以准确、重复地确认细菌，10分钟内不需要额外的消耗品。结果错误或未确认是因为MALDI-TOF-MS数据库不完整，大部分差异是由于与系统数据库相关的分类学差异。，38，2，多血清型细菌的鉴定传统的细菌培养和生化鉴定方法不能对与人类健康密切相关的多血清型病原体(如沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌等)进行分类，需要更多的血清或噬菌体检测等技术。利用MALDI-TOF-MS技术鉴定和分类这种多血清型细菌，在沙门氏菌分类中表现出更好的打字能力，初步应用。在细菌检查中，MALDI-TOF-MS的适用范围，3，耐药不同的菌株部分研究表明，MALDI-TOF-MS是凝固酶阳性和凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌vanderberg university和英国MALDI-TOF-MS在细菌检查中，可以使用40、MALDI-TOF-MS的应用范围4、真菌MALDI-TOF-MS鉴定酵母、酵母样细菌和丝状真菌。Marklein等研究表明，临床分离的250种念珠菌包含15种，96%可以准确确认。5、血液、尿液和其他无菌液体标本使用血清分离管或氯化铵溶血标本，MS直接确认单个细菌感染的79%。MS对尿液标本中的细菌快速准确，尤其对大肠杆菌，正确识别率为97.6%。也有利用MS直接检测和鉴定其他正常无菌液体中的细菌的研究，正确的确认率为96%。在细菌检查中，对41、MALDI-TOF-MS的适用范围、6、粪便标本直接在粪便选择培养基中生长的可疑群体进行MALDI-TOF-MS分析，快速识别和查明日常诱发腹泻的病原体。此方法可以提前2-3分钟对大多数非乳糖发酵正常植物(如大肠杆菌、柠檬酸盐、变形、肠杆菌、摩根细菌等)做出正确的决定。42，MALDI-TOF-MS在细菌检查中快速检测耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，(3) MALDI-TOF-MS应用案例，43，1。制备基质溶液的最佳基质溶液为50mg/mLDHB 50%乙腈0.1%三氟乙酸(TFA)。2.样品制备所有菌株以1%的比例接种在5mLLB培养基上，在37恒温培养振荡器中培养8h。取1mL培养液6000g离心3min，将细菌灭为75%乙醇溶液，向上进行离心分离。用超纯水洗2次菌体后，用1mL超纯水媒介。将1L细菌悬浮液和1L基质溶液充分混合后，在室温下干燥点样品。44，MALDI-TOF-MS使用案例，3 .用质谱测定构成脉冲氮激光(337nm)离子源的Ultraflex系列质谱计，线性模式，阳离子光谱测定，提高22kV的电压控制速度。每个采样随机选择10个不同的点，累2000次，相对激光强度为40%，扫描范围为2000到20000Da。用1pmol的标准肽和标准蛋白质混合物校准系统，错误0.1%.4。数据分析通过FlexAnalysis3.0软件处理质量分析