茶槲寄生“螃蟹脚”中黄烷醇及黄酮醇化合物的HPLC分析

茶槲寄生“螃蟹脚”中黄烷醇及黄酮醇化合物的HPLC分析,导师：李家华博士答辩人：周倩雯2012年5月15日,研究材料与方法,主要内容,研究背景,研究目的,研究结果与分析,1,2,3,4,5,结论,1研究背景,茶槲寄生“螃蟹脚”系桑寄生科槲寄生属植物，是一种寄生在树龄较老的古乔木茶树上的寄生植物，形状像小珊瑚，因寄生枝杆节状带毫，故此被称为“螃蟹脚”。据中华人民共和国药典记载，槲寄生作为我国传统中药，以干燥的带叶茎枝入药，其性凉，有祛风除湿、强筋壮骨等功效。,研究背景,近年来，对槲寄生属的研究发展较快，已有研究表明，槲寄生属植物的主要功能成分为黄酮类化合物等一些高分子化合物。茶槲寄生“螃蟹脚”由于主要寄生在古茶树上，一直以来都很少得到人类的认识和利用。,2研究目的,本文采用HPLC法对“螃蟹脚”的多酚类化合物中的黄烷醇及黄酮醇类物质的组成及其含量进行了检测，为以后对其单体成分的提取、药理作用及分子生物学等方面的研究提供参考。,3研究材料与方法,3.1实验材料：螃蟹脚,采自云南省普洱市澜沧拉祜族自治县的景迈万亩古茶园的古茶树上，样品经日光晒干后置于冰箱保存。,标准品：1）黄酮类标准样：杨梅素标准样，槲皮素标准样（纯度96.5%）、山柰酚标准样（纯度95.9%）2）儿茶素标准样：表没食子儿茶素（EGC，纯度99.8%），表儿茶素（EC，纯度99.8%），表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG,纯度98%），表儿茶素没食子酸酯（ECG，纯度，98.9%）3）试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。,3.2HPLC分析装置和色谱条件,分析装置：美国安捷伦1200型高速液相色谱系统。色谱条件1）黄酮醇类物质的HPLC分析条件流动相：A相：0.2%磷酸水溶液；B相：80%甲醇。梯度从30%B到80%B，流速0.8mL/min，55min内完成，检出波长360nm，柱温40，进样量10L，每次完成后系统平衡10min后再次进样。2）黄烷醇类物质的HPLC分析条件流动相：A相：（0.05MH3PO4-H2O）-5%CH3CN；B相：(0.05MH3PO4-H2O)-80%CH3CN；梯度从9%B到53%B，流速0.7ml/min,55min内完成，检出波长280nm，进样量2.0l每次完成后系统平衡15min后再次进样。,3.3标品溶液的配制,1）黄烷醇类物质混合标准液的制备分别称取4种主要儿茶素标准样5.0mg于50ml棕色容量瓶中加入50ml70%甲醇溶液溶解混匀，作为混合标准样溶液保存备用。2）黄酮醇类物质标准液的制备分别精密称取杨梅素、槲皮素和山柰酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。,加2%磷酸10ml,加10ml甲醇后充分摇匀，静置1小时,过滤，离心后取上清液,50mg“螃蟹脚”样品粉末,0.45m微孔滤膜过滤,黄烷醇类物质HPLC分析用“螃蟹脚”样品供试溶液的制备,黄酮醇类物质HPLC分析用“螃蟹脚”样品供试溶液的制备,“螃蟹脚”粉末1.00g,加甲醇40mL,盐酸4mL,回流水解1.5h（85）,过滤,加甲醇定容至50mL,0.45m微孔滤膜过滤,3.4供试品溶液的制备,3.5茶多酚总含量测定,酒石酸铁法,加沸水450ml,沸水浴45min(每10min摇瓶一次）,过滤，滤液合并于500mL容量瓶，纯水定容,3g“螃蟹脚”样品粉末,吸取茶汤1mL,25mL容量瓶（水4mL，酒石酸铁5mL，缓冲液定容）,10mm比色皿，波长540nm，测吸光度,4研究结果与分析,杨梅素（15.624）,槲皮素（18.233）,山柰酚（21.735）,图A、B为杨梅素、槲皮素和山柰酚标样及“螃蟹脚”中黄酮醇类物质的HPLC色谱图,6（15.450）,6（15.450）,7（18.679）,8（21.745）,从图B可知，“螃蟹脚”中的黄酮醇类物质除杨梅素(15.450min)、槲皮素(18.679min)和山柰酚（21.745min）外，分别在保留时间为2.868min（1），6.643min（2），7.785min（3），8.429min（4），9.811min（5）和22.951min（6）时检测到了峰面积较大的6个组分。目前对“螃蟹脚”中单体黄酮醇的研究尚缺乏，这6个未知组分的成分还有待进一步的研究。,黄酮类分析结果,本文用测得的杨梅素、槲皮素、山柰酚及6个未知组分的含量，以总黄酮醇苷含量=（杨梅素+槲皮素+山柰酚+6个未知组分的含量）2.51的计算公式，测算得了“螃蟹脚”中总黄酮醇苷含量，从结果可看出，“螃蟹脚”中总黄酮醇苷含量达5.83mg/g,茶叶中4种主要的儿茶素及“螃蟹脚”中黄烷醇类物质的HPLC色谱图,表没食子儿茶素,表儿茶素,表没食子儿茶素没食子酸酯,表儿茶素没食子酸酯,“螃蟹脚”中检测出了峰面积相对较大的9个组分的峰，但都与茶叶中主要的4种黄烷醇类物质的保留时间完全不同，说明，“螃蟹脚”中的黄烷醇类物质和茶叶中所含有的黄烷醇类物质不同。,黄烷醇分析结果,除了刚才的的分析结果外，通过酒石酸铁比色法所测得的“螃蟹脚”中多酚类物质的总含量仅为0.84%（8.4mg/g），含量远低于茶叶中多酚类物质的含量。,5结论,螃蟹脚黄烷醇类的组分与茶叶中组分具有明显的差异，其茶多酚总含量远低于茶叶中茶多酚总含量，为0.84%，即8.4mg/g；检测到了包括杨梅素、槲皮素、山柰酚和6个未知组分在内的9个黄酮醇组分，结果计算出总黄酮醇苷含量为5.83mg/g；,表明螃蟹脚中是黄酮醇占茶多酚总含量的大部分（69.40%），而不是儿茶素。,致谢,首先，要特别感谢我的导师李家华老师的指导与督促，从选题到成文，李家华老师都提出了许多宝贵的意见