分子生物学-转录PPT课件VIP

.,第十六章,RNA的生物合成RNABiosynthesis,.,掌握：DNA复制和转录的区别掌握：转录模板的特点和所需的酶理解：原核和真核生物转录的过程及二者间的差异熟悉：真核生物mRNA的加工过程（掌握断裂基因、内含子、外显子的概念）了解：tRNA和rRNA的加工,学习目标,.,在生物界，RNA合成有两种方式：,一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependentRNAsynthesis)，也叫RNA复制(RNAreplication),由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。,.,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程(原料、原则、酶、方向）。,转录,.,复制和转录的相同点,酶促的核苷酸聚合；DNA为模板；依赖DNA的聚合酶；生成3，5磷酸二酯键；53方向聚合；遵从碱基配对规律。,.,复制和转录的区别,引物需要不需要,.,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,.,模板和酶TemplatesandEnzymes,第一节,.,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,一、转录模板,不对称转录,.,不对称转录(asymmetrictranscription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,.,DNA分子上能转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作无意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为有意义链或Crick链。,.,5GCAGTACATGTC3,3cgtgatgtacag5,5GCAGUACAUGUC3,NAlaValHisValC,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,.,RogerKornbergWonNobelPrizeforchemistry2006.,二、RNA聚合酶,.,（一）RNA聚合酶催化RNA链合成的机制,RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,RNA,延长的RNA,.,DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。,.,（二）原核生物的RNA聚合酶（1种）,.,核心酶(coreenzyme),全酶(holoenzyme),参与转录延伸,参与转录起始,.,.,利福平和亚基结合抑制RNA聚合酶,.,（三）真核生物的RNA聚合酶（3种）,均由多个亚基构成，抑制剂鹅膏蕈碱（毒蘑菇“死亡之伞”）,.,Amanitaphalloides（deathcap）,-amanitin,.,真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基.RNA聚合酶由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。,.,原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote,第二节,.,（一）转录起始,一、原核生物的转录过程,起始延长终止,.,2.DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomplex)；,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,转录起始过程：,4.亚基脱落,.,1、模板上酶的辨认、结合,调节序列,转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。调控序列中的启动子是RNA聚合酶最先结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。,.,原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录，其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。,.,RNA聚合酶保护法（Footprinting）,.,.,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATATATTA,-10区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),.,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合:,.,E.coli开放转录复合体的形成,.,2.DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomplex)；,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,转录起始过程：,4.亚基脱落,cycle,.,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,.,UnwindinggeneratessupercoilsintheDNAthatcanberelievedbyDNAtopoisomerases.ActinomycinDwasthefirstantibiotictofindtherapeuticapplicationintumorchemotherapy.ItbindstotheDNAtemplateandinterfereswiththemovementofRNApolymerasealongtheDNA.,.,转录空泡(transcriptionbubble)：,RNA-pol（核心酶）DNARNA,.,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。,这种形状说明：,.,原核生物的边转录边翻译电镜照片,.,识别转录起始部位。与模板链结合，并使DNA双链打开。催化NTP的聚合。缺乏外切酶活性,无校对功能。不同的识别不同的转录起始位点。,RNA聚合酶作用特点,.,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,.,1.非依赖Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录，这种方式较普遍。,反向重复序列与发夹Invertedrepeatsandhairpins,5NNGAATGCCNNNGGCATTCNN33NNCTTACGGNNNCCGTAAGNN5,5NNGAAUGCCNNNGGCAUUCNN3,.,茎环/发夹结构,.,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,.,ATP,2.依赖Rho因子的转录终止,相对少见，主要见于噬菌体。,.,Rhofactor:ATPaseactivityhelicaseactivity易与polyC结合,.,真核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninEukaryote,第三节,.,（一）转录起始前的上游区段,不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-actingelement)。,一、真核生物的转录起始过程,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,.,顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstreampromoterelements)或promoter-proximalelements)等近端调控元件和增强子(enhancer)、沉默子等远隔序列。,.,一个典型的真核生物基因上游序列:,起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATAbox)。TATA盒和Inr一起通常被称为核心启动子。,.,TATA盒的作用在于决定转录的起点，序列的改变会使转录位点偏移；缺失TATA盒，转录将在许多位点上开始。TATA盒决定转录的效率：如鸡蛋清蛋白基因启动子的TATA变为TAGA后，转录效率大大下降,.,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-actingelement),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,.,（二）转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)，或基本转录因子/通用转录因子。,.,参与RNA-pol转录的TF,稳定TFD-DNA复合物，结合RNApol促进RNApol结合及作为其它因子结合的桥梁解螺旋酶，结合TFH解旋酶，作为蛋白激酶催化CTD磷酸化,.,（三）转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,.,TFF,A,B,由RNA-Pol催化转录的PIC（pre-initiationcomplex),H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH解开双螺旋并使CTD磷酸化,.,型基因中的四类转录因子,.,RNA聚合酶II与启动子的结合、启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。通常包括多种顺式作用元件与反式作用因子的作用、因子和因子之间互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、何时转录以及转录的效率。,.,PIC的形成,.,（四）拼板理论(piecingtheory),为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。拼板理论(piecingtheory)：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,.,二、转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,.,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,.,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAAGTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA3mRNA,三、转录终止,和转录后修饰密切相关。,.,复制与转录特点比较,.,真核生物的转录后修饰Post-transcriptionalModification,第三节,.,真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物(primaryRNAtranscript)，几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA。加工主要在细胞核中进行。,.,几种主要的修饰方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.化学修饰(modification),4.添加(addition),5.编辑,.,一、真核生物hnRNA的加工包括首、尾修饰和剪接,（一）hnRNA在5-末端加“帽”,大多数真核mRNA的5-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构。这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(cappingenzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。,.,帽子结构（5m7GpppGp）,.,5pppGp,5GpppGp,帽子结构的生成,.,m7Gpppm7GpppN1mp,.,m7GpppN1mpN2mp,.,帽子结构功能：(1)保护mRNA免受核酸酶水解(2)与帽结合蛋白质复合体结合，并参与mRNA和核糖体的结合，与翻译起始有关(3)与mRNA向核外的转运有关(4)增强mRNA剪接效率,.,尾结构：polyA加尾过程：先由核酸外切酶切去3末端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA,（二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,.,多聚腺苷酸聚合酶（poly(A)polymerase,PAP）,.,利用polyA纯化mRNA,.,尾功能：（1）保护RNA，防止被水解（2）与翻译起始有关（3）与mRNA向核外的转运有关注意：并不是所有基因的转录产物都有polyA尾。,.,断裂基因（外显子和内含子）,why,what,hnRNA,HOW,二次转酯反应,（三）hnRNA的剪接,TOOL,snRNA,剪接体,.,1993年诺贝尔生理学或医学奖得主,罗伯茨RichardJ.Roberts美国贝弗莉新英格兰生物实验室1943年-,夏普PhillipA.Sharp美国麻省理工学院癌症研究中心1944年-,why,.,.,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目录,why,.,真核生物中的结构基因由若干个编码区和非编码区相互间隔，但又连续镶嵌而构成，因此真核生物的结构基因称为断裂基因。,断裂基因(splitgene),编码区A、B、C、D,why,.,外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,注意：并不是所有外显子均表达，所有内含子均不表达。,why,.,.,内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,.,剪接体（spliceosome）,WHO,2015年8月，酵母剪接体的高分辨率结构2016年12月又陆续报道了酵母剪接体在不同工作状态下的高分辨结构2017年5月12日，人源剪接体的原子分辨率结构,.,tool,snRNA(smallnuclearRNA)种类：U1,U2,U4,U5,U6,GUAAGU,AG,UACUACA,共有序列,支点序列,5,3,exons（外显子）introns（内含子）,hnRNA,HOW,内含子的结构,.,IVS-2-654(CT)剪接突变是-地中海贫血的一种最常见的基因突变,据统计，1/3以上的遗传性疾病与RNA剪接异常有关。,.,U1snRNP与U2snRNP的识别结合,HOW,.,SnRNPs对内含子的识别结合,branchsitesequence,U1snRNA,U2snRNA,A,5splicesite,U1snRNP,U2snRNP,3splicesite,剪接体,U1,U2,U5,U4/U6,U4,5,3,5,5,5,3,3,3,U5,U4/U6,lariatform（套索状结构）,剪接过程,HOW,第一次转酯反应,第二次转酯反应,剪接的机制二次转酯反应,HOW,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,.,选择性剪切选择性剪接,前体mRNA分子可发生可变剪接和可变剪切,.,剪接小结,对象,hnRNA,原因,工具,断裂基因、外显子、内含子,剪接体(snRNPs、snRNA),过程,套索状结构,机制,二次转酯反应,.,（三）.mRNA的编辑(mRNAediting),概念：对mRNA外显子的加工过程，mRNA转录后通过插