生命科学进展ppt课件

生命科学进展,罗晓霞,1,中心法则,生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能，基因功能的具体体现者就是蛋白质。,前言：,2,蛋白质相互作用,蛋白质可以通过某种方式与蛋白质，核酸或其他分子之间发生相互作用而形成一定形态的蛋白复合物。,多亚基蛋白复合体,酶-底物,抗原-抗体,3,研究蛋白质相互作用的重要意义,绝大多数疾病都是由特定蛋白质相互作用所致。对200种蛋白质及2000种组合结构进行解析后，发现其中三分之一的蛋白质相互组合会导致疾病；容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病情恶化。,蛋白质相互作用和识别在诸如DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌，生物催化、物质转运、新陈代谢、信号传导、免疫、细胞调控等多种重要的生命过程起着重要的作用。,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。,4,每一种蛋白质不是孤立存在于细胞中，而是与其它蛋白质或核酸或其他小分子一起进行相互作用来行使其功能，从而使得细胞中所有蛋白质形成一个相互作用的网络，同时功能相同和相似的蛋白质在一起组成相关的功能模块，以完成相关的生理功能。,蛋白质相互作用网络,5,蛋白质相互作用的检测和分析方法,一，酵母双杂交系统，YeastTwo-HybridSystem；,二，噬菌体表面展示技术，PhageDisplay；,1.谷胱苷肽-S-转移酶沉淀，GST-pulldown；,三，基于亲和层析的蛋白质相互作用研究平台,2.免疫共沉淀，Co-immunoprecipitation；,3.亲和印迹，Ligandblot。,6,一，酵母双杂交系统YeastTwo-HybridSystem,1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法，以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。,Stelzl等(2005)和Raul等(2005)则先后分析了人脑组织、人已知ORF中大规模的蛋白质相互作用网络。,Rain等(2001)用该法绘制了人类胃肠道病原菌Helicobacterpylori的大规模蛋白质相互作用图谱。,随后，Giot等(2003)和Li等(2004)在果蝇和线虫中也成功地研究了大规模的蛋白质相互作用。,7,酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。,酵母双杂交系统工作原理,8,酵母双杂交实验流程,9,酵母双杂交系统的应用范围,检测已知蛋白质之间的相互作用；确定蛋白质相互作用功能区域位点；筛选与靶蛋白发生相互作用的未知蛋白。,10,不需分离和标记靶蛋白，采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达，避免蛋白质纯化过程；检测在活细胞内进行，真实反应体内蛋白质间相互作用情况；敏感度高，可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；可进行高通量筛选；成本低，无需特殊的检测设备。基因型和表型相联系，可直接得到相互作用蛋白的编码序列。,酵母双杂交系统的优点,11,限于检测定位于细胞核内的蛋白质间相互作用；假阳性：本身具有激活转录功能的蛋白；cDNA反向插入；融合蛋白可能会影响蛋白的真实结构和功能。蛋白质与蛋白质,酵母双杂交系统的局限性,12,二，噬菌体表面展示技术PhageDisplay,噬菌体：感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。,13,1985年Smith证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造。1988年Parmley将已知抗原决定簇与噬菌体PN端融合呈现在其表面。1990年McCafferty用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。一系列噬菌体文库的构建噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。,噬菌体展示技术的发展简史,14,利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。,在噬菌体pIII和p衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白或cDNA文库，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；,外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。,噬菌体表面展示技术原理,15,噬菌体表面展示操作流程,构建cDNA文库，使外源基因与外壳蛋白基因融合，导入噬菌体,Display,Bindtoantigen,Washtoremoveunboundphage,Elute,Amplify,Analyze,Detect,Elisa,噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。,16,大规模筛选与特异抗体或受体相互作用的未知蛋白质；研究抗体或受体与抗原或底物的结合位点；可用于构建随机多肽库、抗体库和蛋白文库；研究新型多肽药物、疫苗和抗体；可研究蛋白质与核酸相互作用的生物学过程；非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究；酶作用底物的分析。,噬菌体表面展示应用范围,17,应用范围非常广；可用于高通量筛选；可研究含量很低的与配体特异作用的蛋白质；可直接得到相互作用蛋白的编码序列。,噬菌体表面展示优点,需要标记的抗体或配体来检测结合情况；外源蛋白大小受到限制，不能研究大分子量蛋白质的相互作用；原核表达体系中外源蛋白质无法正确折叠或修饰；融合蛋白可能会影响到蛋白质本身的结构或生物活性。,噬菌体表面展示缺点,18,1.谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pulldown),三、基于亲和层析的蛋白质相互作用研究平台,2.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),3.Ligandblot,基本原理是将一种蛋白质或抗体固定于某种基质上（如Sepharose，NC膜或PVDF膜等），当细胞抽提液经过改基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来，然后对其进行分析鉴定。,19,1.谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pulldown),1988年smith等利用谷胱甘肽S转移酶融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白，从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。,GST-pulldown方法是将诱饵蛋白质和GST标签融合表达。一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液培育，之后利用谷胱甘肽琼脂糖球珠将融合蛋白:目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。,20,GST,X,谷胱甘肽-琼脂糖球珠,细胞裂解物,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,X,Y,GST-pulldown筛选未知的结合蛋白,设置GST对照，排除GST的影响,Y,Y,Y,Y,Bind,Washtoremoveunboundprotein,Elute,Analyze,Bind,21,GST-pulldown验证两个已知蛋白的相互作用,GST,X,谷胱甘肽-琼脂糖球珠,纯化的Y蛋白,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,+,+,GST,纯化的Y蛋白,GST,Y,Y,Y,Bind,Washtoremoveunboundprotein,Detect,Bind,Bind,22,不需要制备抗体来检测结合情况；不需要对诱饵蛋白进行标记，避免了使用同位素等危险物质；,GST-pulldown的优点,GST-pulldown的缺点,2.假阳性。蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。,该方法只适用于确定体外的相互作用；,3.融合蛋白可能会影响蛋白的真实结构和功能。,23,原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。之后纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。,2.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),24,Binding,wash,elution,细胞裂解物,Detection,免疫共沉淀技术流程,25,检测是在生理条件下进行，可以真实地体现在生命过程中蛋白质之间的相互作用；可进行大规模的筛选；可检测依赖于修饰的蛋白质之间的相互作用;可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。,免疫共沉淀技术的优点,免疫共沉淀技术的缺点,灵敏性不高。不能检测和分析低表达量的蛋白之间的相互作用；假阳性。受免疫球蛋白的干扰容易产生假阳性；需要制备高质量抗体。以终产物为检测对象，检测不到瞬间有相互作用的蛋白质；,26,3.亲和印记，Ligandblot,将PAGE胶上分离好的蛋白样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记的诱饵蛋白发生作用，最后通过显影或显色反应信号确定相互作用蛋白，最后通过质谱对其进行鉴定。,27,诱饵蛋白的标记技术,PNAS,2007,JBC,2005,FEBSJ,2008,样品蛋白的分离和固定技术,Ligandblot的应用,BBRC,2007,28,1.转膜前需要将蛋白质复性，不能完全恢复到天然状态；,Ligandblot技术的缺点,2.需要对蛋白进行标记或要制备抗体；,2.灵敏度不高，很难鉴定分离低表达量的相互作用蛋白；,2.实验在体外进行，很难鉴定修饰的蛋白或蛋白复合体。,Ligandblot技术的优点,1.操作简便，尤其是对于在变性条件下也能发生相互作用的蛋白的鉴定和验证；,2.可鉴定靶蛋白与受体的结合位点。,29,Outline,RegulatoryRNAsinBacteriaDiscoveryofsRNATargetofsRNAPredictionsRNAinBacilluscereusgroup,30,RegulatoryRNAsinBacteria,RiboswitchesCRISPRsRNAs(smallRNAs),31,Riboswitches,位于所调节的mRNA的5端与所调节的mRNA一起转录通过改变RNA的结构来影响转录或翻译由两部分组成：aptamerregion，结合配体；expressionplatform，改变RNA结构能感应氨基酸，核苷酸，金属离子等小分子，也能感应细胞组分（如特殊的tRNA），还能感应温度等环境因素,32,Riboswitches的响应配体的作用方式,通过改变mRNA的结构影响转录或翻译,WatersandStorz,Cell,2009,33,Riboswitches响应温度的作用方式,低温时，SD序列与ASD序列配对形成茎环结构，当温度升高时，茎环结构解开，露出SD序列,Henkin,GenesDev.,2008,34,CRISPR结构与功能,CASgene:CRISPR-associatedgene功能多数未知，但往往具有DNA或RNA结合domain，解螺旋酶Domain，内切酶或者外切酶domainLeadersequence：大概550bp左右RepeatedDNA：24-47bp，重复2-249次Spacer：26-72bp,WatersandStorz,Cell,2009,35,CRISPR介导的phage抗性,Soreketal.,Nat.Rev.Microbiol.,2008,36,sRNA,sRNAsthatModulateProteinActivityCis-encodedbasepairingsRNATrans-encodedbasepairingsRNAExtendofsRNA,37,sRNAsthatModulateProteinActivity,大肠杆菌中作用的例子,WatersandStorz,Cell,2009,38,Cis-encodedbasepairingsRNA,具有独立的启动子和转录终止子，没有ORF一般由目标mRNA的互补链编码，直接位于ORF的互补链或者operon的中间与目标mRNA某区域完全配对目前大部分来源于噬菌体，质粒，转座子；在质粒中，调节复制，分离等；在转座子中调节转座频率；在噬菌体中，调节溶原与溶解,Brantl,FutureMicrobiol.,2009,39,ActionmenchanismofCis-encodedbasepairingsRNA,直接结合到RBS区或者mRNA中间，引起mRNA降解或者翻译终止,WatersandStorz,Cell,2009,40,Trans-EncodedBasePairingsRNAs,往往位于基因之间的间隔区，有独立的启动子和转录终止位点长度一般50到600bp，主要是50到200nt之间与目标基因相隔较远与目