第十四章 溶菌酶.ppt

第十四章溶菌酶、食品的防腐保鲜一直是食品领域需要解决的重要问题微生物是导致食品腐败变质的最有效的解决方法添加食品防腐剂现在使用最多的化学防腐剂天然食品防腐剂3354溶菌酶的研究开发备受关注， 问题的建议是EC.3.2.1.17，系统名称为N-乙酰血清素水解酶简称细胞壁酶溶菌酶的研究自尼科耳(Nicoile)1907年发表枯草菌溶解因子的报告开始两年后，Laschtschenko发现鸡蛋白的强抗菌作用是酶作用的1922年英国细菌学家A.Fleming发现在人的唾液和眼泪中存在溶解细菌细胞壁的酶，将其命名为溶菌酶。 Lysozyme(LZM )，一、溶菌酶的来源于分布，广泛存在于人体的多种组织中，并且有鸟类和家禽的蛋白； 哺乳动物的眼泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液微生物； 蛋白含量最丰富。 比较溶菌酶的含量，来源于不同的溶菌酶，活性不同。 其中，人溶菌酶活性最高，分别为蛋白溶菌酶的3倍、牛奶溶菌酶的3000倍(K.J.Losnedahl，1998 )。 蛋白、植物、微生物发酵、二、性质和作用机理、性质：溶菌酶的纯品为白色或微黄、黄色结晶体或非晶粉末，无异味，在遇到容易溶解于甜水中的碱时稳定在容易破坏的酸性pH值，此时100的加热对溶菌酶只有微小的活性损失抗菌机制，细菌的细胞壁由细胞壁质构成，细胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamineNAG )和N-乙酰瓜氨酸(N-acetylmuramicacidNAM )交替构成的多聚体，在细胞壁酸残基多肽多烯由NAM、NAG和肽“尾”(一般为4氨基酸)构成，NAM和NAG由-l、4糖苷键结合，肽“尾”由D-内酯羧酸与NAM的第3位碳原子结合，肽尾间为肽“桥”(肽) 溶菌酶的功能图，肽链中由Glu35和Asp52构成的活性中心为，LZM，细菌细胞壁肽多糖类分子中的NAM和NAG之间的-1， 集中作用于4键，催化细菌细胞壁中肽多糖的水解，破坏细菌细胞壁，溶解细菌而死的溶菌酶直接与带负电荷的病毒蛋白质结合，与DNA、RNA、脱辅助蛋白形成复盐，使病毒失活。 因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。 由于g细菌和g细菌细胞壁中的多肽含量不同，g细菌细胞壁大部分由多肽蛋白组成，g细菌只有内壁层是多肽蛋白，溶菌酶只能破坏g细菌的细胞壁，但对g细菌不太起作用。 三、溶菌酶的种类，根据来源把溶菌酶分为四种动物源溶菌酶：鸡蛋白溶菌酶，人和哺乳动物溶菌酶植物源溶菌酶微生物源溶菌酶噬菌体源溶菌酶，常见的几个溶菌酶，1， 蛋白溶菌酶-用于保持新鲜度的蛋白溶菌酶占蛋白总蛋白的3.4%3.5%，作为溶菌酶类的典型代表，目前是重要的研究对象，也是最熟悉溶菌酶的一种。 从蛋白中分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基组成的单一多肽链。 碱性氨基酸丰富，4对二硫化物键是维持酶配置的碱性蛋白质，其n末端是赖氨酸，c末端是亮氨酸。 由四条多肽链组成。 相对分子量14000等电点为10.8的最佳温度为50，最佳pH为67。 化学性质非常稳定，即使在pH1.211.3的范围内急剧变化，结构也很稳定。 热也稳定，在ph47，100下处理1min，虽然是稳定的碱性蛋白质，但是在碱性条件下对热的稳定性差。分解g细菌，但不作用于g细菌，与从其他鸟类，例如鹌鹑、珍珠鸡、火鸡等蛋白中分离纯化溶菌酶的蛋白溶菌酶的活性很相似，由129个氨基酸构成，虽然序列顺序不同，但活性部位也不同，但活性部位的氨基酸序列几乎相同人和哺乳动物溶菌酶，人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液和淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中，1ml眼泪中含有溶菌酶7mg，1ml乳汁中含有0.10.5mg。 人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14600，其溶菌酶活性比鸡蛋溶菌酶高两倍。 哺乳动物溶菌酶，目前从牛、猪、猫、兔子、猴子、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但是结构不明，其溶菌酶的活性也远远低于人溶菌酶的3000倍。 曾林(1999 )采用琼脂平板法测定兔初乳溶菌酶的含量。 结果初乳溶菌酶的含量为(7.962.01)g/ml，常乳溶菌酶的含量为(5.011.32)g/ml。 人和哺乳动物溶菌酶的作用机制与鸡蛋清溶菌酶相同。 3、植物溶菌酶，现在从木瓜、无花果、霉变、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量约为2400029000。 植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性在鸡蛋清溶菌酶的三分之一以下，而对胶体状甲壳质的分解活性却是鸡蛋清溶菌酶的十倍。 周泽文(1994 )从菜心中分离溶菌酶，酶比活力达到3414.6U/mg，纯化倍率为197.4。 菜心溶菌酶在宽温度和pH栽培范围内有活性，最佳温度为60，最佳pH值为5.8。 高日向(1997 )的萝卜溶菌酶有白色葡萄球菌、黄色葡萄球菌、枯草棒3种革兰氏阳性菌和变形菌、大肠菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀巴斯德菌、小鸡痢疾沙门氏菌、产气菌6种革兰氏阴性菌和酿酒酵母、总毛霉菌、黑根霉菌、阿斯同时，研究了萝卜溶菌酶对白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、西红柿青枯病菌、水稻细线病菌、水稻白叶枯病菌、烟草青枯病菌6种植物病原细菌的抗菌效果。 试验证明，萝卜溶菌酶对参加上述试验的菌种有一定的抗菌作用。 4、微生物产生的溶菌酶，根据其作用对象，细菌细胞壁溶菌酶真菌细胞壁溶菌酶，细菌细胞壁溶菌酶，N-乙酰基氨基己葡萄糖苷酶：细菌细胞壁多肽多糖中的-(1 4 ) 糖苷键胺酶：催化分解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰基瓜氨酸和肽“尾”之间的N-乙酰基瓜氨酸-L-丙氨酸键内肽，细菌细胞壁溶菌酶的抗菌活性不仅能分解细菌细胞壁，而且在酶不可逆性抑制后也能抑制抗菌效果真菌细胞壁溶菌酶：几丁质酶、-葡聚糖酶、几丁质酶主要用于降解和重组真菌细胞壁，而产生几丁质酶的真菌多主要用于真菌细胞壁的形成过程，多肽蛋白和壳聚糖骨架具有相似的结构，几丁质酶也具有溶菌酶活性例如，- (1，3 )葡聚糖酶水解- (1，3 )糖苷键，对甲壳素分解真菌细胞壁发挥显着协同作用，并用纯化的甲壳素酶和-葡聚糖酶，其抗灰色葡萄孢子(Botrytiscinera )作用为10倍，5，细菌蛋白四、溶菌酶应用过程中出现的优点有： (1)溶菌酶是非常稳定的蛋白质，具有较强的耐热性。蛋白溶菌酶是已知的耐热性最高的酶(2)溶菌酶在有机溶剂的处理中不会失活，转移到水溶液中后溶菌酶的活力就会恢复(3)溶菌酶被冷冻或干燥处理，活力稳定的(4)溶菌酶适合pH5.36.4， 可以用于低酸性食品的防腐，(5)溶菌酶的生产成本低(6)溶菌酶的抗菌光谱广，不仅对g菌，对g菌的一部分也有抑制效果(7)溶菌酶作为防腐剂安全性高。 溶菌酶是天然蛋白质，1992年FAO/WTO食品添加剂协会认定溶菌酶在食品中的应用是安全的。 五、溶菌酶的应用，溶解微生物细胞壁，对人体细胞不产生影响。 广泛应用医药、食品灭菌领域。 消除炎症，去除坏死组织等。 食品防腐保鲜-非加热的方法。 (1)保持奶酪的新鲜度，在奶酪生产中添加一定量的溶菌酶，防止微生物污染引起的丁酸发酵，保证奶酪的质量。 (2)水产品的保鲜、虾等，容易腐败。 冷冻和盐渍的方法很新鲜，但是设备很贵，或者盐渍的风味变了。 将一定浓度的溶菌酶散布于水产品中，起到防腐保存的作用。 (3)低浓度酿造酒保鲜，酿造酒酒精含量低，微生物生长，引起变质。 清酒酒精含量为1517%时，很多微生物无法生长，但乳酸菌落火菌会生长出不良的风味。 水杨酸是防腐剂，但是太多会伤害胃和肝脏。 加入15mg/kg的溶菌酶，发挥防腐作用；(4)乳制品的保鲜与强化；Freshmilk，13mg/mlHumanmilk，强化40mg/ml的溶菌酶，发挥防腐保鲜、人的乳化作用。 (5)其他食品保鲜、香肠奶油保鲜(生)面条、奶油蛋糕是一种容易腐烂的食品，在点心中加入溶菌酶，可以防止微生物繁殖，发挥防腐作用。 章银良研究了溶菌酶对草莓的保鲜作用，发现溶菌酶和甘氨酸合用对草莓保鲜效果更好。 由于酵母细胞壁中蛋白质的利用率低，利用溶菌酶破坏酵母细胞壁，生成微生物蛋白质，提高酵母蛋白质的利用率。 用含放线菌体的溶菌酶处理酵母液，可生产5-肌苷酸、5-鸟苷酸及其他呈味物质。 将溶菌酶固定在食品包装材料上，生产具有抗菌效果的食品包装材料，实现抗菌保鲜功能。 目前，许多肉制品的软包装需要高温灭菌处理。 处理过的肉制品脆性变差，可以蒸煮味。 如果在产品真空包装前添加一定量的溶菌酶(1%3% )，然后进行集市杀菌(80100、2530min )，则可以得到良好的保鲜效果。 (6)在食品包装工业中的应用，溶菌酶是无毒无害的高碱性蛋白质，具有一定的保健作用，有抗感染和抗生素增强作用，促进血液凝固和止血作用，有组织再生作用。 因此，可以在保健食品中添加一定量来提高保健效果。 (7)功能性食品的应用，酶的特异性：对酵母、霉菌、G-引起的腐败变质效果不理想。 酶的稳定性和有效期。 是医学上应用，具有杀菌作用的天然抗感染物质。 具有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛、加速组织恢复功能等作用。 临床用于慢性鼻炎、急慢性咽炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹、扁平疣等。 也可以结合抗菌药治疗各种细菌和病毒感染。 口服和肌肉注射都有效。 口服，35片/次(肠溶性片包含10mg )，3次/日。 嘴里1片/次(嘴里20毫克)，46次/日。 外用：用1%2%的溶液点滴、涂抹或直接喷涂粉。 肌肉注射，50mg100mg/次，12次/日。 滴眼：使用2%溶液。 副作用，偶尔有轻微的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，具有分散浓痰、抑制出血、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用的氯化溶菌酶制药有消炎痔疮、感冒治疗、皮肤病、眼、鼻、喉等药品，7 .溶菌酶市场行情，目前在国内外很受欢迎中国黑龙江、辽宁、天津、北京、河北、河南、山西、山东、湖南、湖北、浙江、江苏等地生产蛋白溶菌酶。 但是，很多企业的生产能力有限，无法保证产品质量，生物活性低(1700-5，000 u/mg )，价格也便宜(2000-4，000元/kg )。 国内溶菌酶的防腐剂产品很少，但是日本的Q.P .公司于2000年将该注册产品LYSOPOWDERP-2投入市场。 溶菌酶制剂，白色结晶。 碱性蛋白质，等电点PH10.511.0。 溶菌酶产品活力2.0万u/mg。 溶解在稀薄的盐水中，在丙酮和乙醇