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文档简介
1材料和方法1.1 样品来源四川 成都 菊乐酸奶(A D),盈棚小米椒(B),红原酸奶(C E F)1.2 培养基1.2.1 MRS培养基蛋白胨 10.0 g酵母膏 5.0 g牛肉膏 10.0 g葡萄糖 20.0 g柠檬酸二铵 2.0 g无水乙酸钠 5.0 g Tween80 1.0 ml MgSO47H2 O 0.2gMnSO4H2O 0.05g琼脂 15g蒸馏水 1000ml注:pH=6.26.4 ,115 C 灭菌30min 。1.2.2 PY培养基蛋白胨 10.0g酵母膏 10.0g盐溶液 40.0ml蒸馏水 1000ml注:调pH至7.07.2,121灭菌15min。盐溶液:无水 CaCl2 0.2g MgSO47H2O 0.48gK2HPO4 1.0g NaCl 2.0gKH2PO4 1.0g NaHCO3 10.0g蒸馏水 1000mL4 备用。1.2.3 PYG培养基蛋白胨 10.0g酵母膏 10.0g盐溶液 40.0ml葡萄糖 10.0g蒸馏水 1000ml注:调pH至7.07.2,121灭菌15min。1.2.4明胶基础培养基蛋白胨 1.0g牛肉膏 1.0g明胶 12.0g葡萄糖 0.1g盐溶液 4.0ml蒸馏水 1000mL115高压灭菌30min。1.2.5 产葡聚糖试验培养基:胰蛋白胨 10.0g酵母提取物 5.0g柠檬酸三铵 5.0g磷酸氢二钾 5.0g葡萄糖 50.0g琼脂 15.0g115灭菌30min。1.2.6 溶性淀粉培养基向PY基础培养基中加入0.5的可溶性淀粉。 1.2.7 氨酸水解试验培养基蛋白胨 5.0g肉浸膏 5.0g葡萄糖 0.5gL-精氨酸 10.0g吡多醛 5.0mg蒸馏水 1000mL1.6g/100ml溴甲酚紫乙醇溶液 0.625g甲酚红液 2.5mlpH 6065,3ml管分装,121灭菌15min。1.2.8石蕊牛奶培养基脱脂奶粉 100g,25g/L 石蕊 40ml蒸馏水 1000ml115灭菌30min1.2.9柠檬酸盐斜面培养基柠檬酸钠 3.0gNH4H2PO4 1.0gMgSO4 0.2gK2HPO4 1.0gNaCl 5.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000ml调PH 至7,加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10ml,培养基呈绿色,分装试管,每管5ml,12130min。1.2.10 含硝酸钾的营养肉汤加入2g硝酸钾入营养肉汤。1.3 主要试剂与溶液(1) 过氧化氢,溴甲酚紫,可溶性淀粉,卢戈氏碘液,甲基红酒精溶液,(2) 脱脂奶粉,硝酸钾,凡士林,石蕊,(3) 溴甲酚紫指示剂:1.6g溴甲酚紫,蒸馏水100ml。卢哥氏碘液:碘1.0g,碘化钾2.0g,蒸馏水300ml。精氨酸液:L-精氨酸1.5g,lg/10ml蒸馏水的半胱氨酸溶液0.05ml,蒸馏水 10ml,调pH 7.0,灭菌后备用。奈氏试剂:A液(氢氧化钾20g,蒸馏水50m1)与B液(碘化钾5g,碘化汞10g,蒸馏水50m1)混合后过滤,贮存于暗色瓶内备用。BTB-MR试剂:BTB 0.2g,MR 0.1g,95乙醇300ml,蒸馏水200ml。1.4试验器材载玻片,盖玻片,倒管,试管,培养皿,比色盘。2 试验方法2.1形态和培养特征观察 采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37下培养2024h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导2.2生长条件试验 (1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7) ;分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。2.3生理生化试验 过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37培养20h24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。葡萄糖产酸产气实验在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。淀粉水解实验接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应甲基红(M.R)试验接种实验细菌于PYG培养基,于37培养2天后,于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,表示阳性。乙酰甲基甲醇V-P实验接种新鲜的实验菌种于PY基础培养基中, 37培养2天后,取培养液1mL在其中加入1ml 10的NaOH,混匀,再加入34滴2%氯化铁溶液。数小时后,培养基表面的下层出现红色者,为V-P阳性。柠檬酸盐取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上,适温培养37天,培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应,不变者则为阴性酪素水解试验牛奶平板的制备:取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中(或用50mL脱脂牛奶),另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中,将两液分开灭菌。待冷至4550时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板。将平板倒置过夜,使表面水分干燥,然后将菌种点接在平板上,每皿可点接35株菌。适温培养1、3、5天,记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时,切勿将牛奶和琼脂混合灭菌,以防牛奶凝固厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性(10)厌氧硝酸盐产气接种封油:以斜面菌种用接种环接种后,用凡士林油(凡士林和液体石蜡为1:1)封管,封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。观察结果:培养27d,观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生,表示反硝化作用产生氮气,为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡,则只能按可疑或阴性处理。(11)石蕊牛奶的反应接种新鲜活跃菌种至石蕊牛奶培养基,37,培养l3天后观察结果。牛奶液化表示产酸,为阳性。牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况(12)碳水化合物发酵产酸试验在PY基础培养基中分别加入碳水化合物至最终浓度为1,分装试管,高度为45cm,灭菌后接种,37培养48h,取未加碳水化合物的PY基础培养基做对照,使用BTB-MR试剂指示产酸程度。(13)精氨酸产氨试验接种试验的菌株到含精氨酸的PY培养基中,并同样接种至不含精氨酸的培养基作为对照,37,培养l3天。取已生长好的培养液少许置至比色盘
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