乳酸菌的生理生化特性(2)1

1材料和方法1.1 样品来源四川 成都 菊乐酸奶（A D）,盈棚小米椒(B)，红原酸奶（C E F）1.2 培养基1.2.1 MRS培养基蛋白胨 10.0 g酵母膏 5.0 g牛肉膏 10.0 g葡萄糖 20.0 g柠檬酸二铵 2.0 g无水乙酸钠 5.0 g Tween80 1.0 ml MgSO47H2 O 0.2gMnSO4H2O 0.05g琼脂 15g蒸馏水 1000ml注：pH=6.26.4 ，115 C 灭菌30min 。1.2.2 PY培养基蛋白胨 10.0g酵母膏 10.0g盐溶液 40.0ml蒸馏水 1000ml注：调pH至7.07.2，121灭菌15min。盐溶液：无水 CaCl2 0.2g MgSO47H2O 0.48gK2HPO4 1.0g NaCl 2.0gKH2PO4 1.0g NaHCO3 10.0g蒸馏水 1000mL4 备用。1.2.3 PYG培养基蛋白胨 10.0g酵母膏 10.0g盐溶液 40.0ml葡萄糖 10.0g蒸馏水 1000ml注：调pH至7.07.2，121灭菌15min。1.2.4明胶基础培养基蛋白胨 1.0g牛肉膏 1.0g明胶 12.0g葡萄糖 0.1g盐溶液 4.0ml蒸馏水 1000mL115高压灭菌30min。1.2.5 产葡聚糖试验培养基：胰蛋白胨 10.0g酵母提取物 5.0g柠檬酸三铵 5.0g磷酸氢二钾 5.0g葡萄糖 50.0g琼脂 15.0g115灭菌30min。1.2.6 溶性淀粉培养基向PY基础培养基中加入0.5的可溶性淀粉。 1.2.7 氨酸水解试验培养基蛋白胨 5.0g肉浸膏 5.0g葡萄糖 0.5gL-精氨酸 10.0g吡多醛 5.0mg蒸馏水 1000mL1.6g/100ml溴甲酚紫乙醇溶液 0.625g甲酚红液 2.5mlpH 6065，3ml管分装，121灭菌15min。1.2.8石蕊牛奶培养基脱脂奶粉 100g，25g/L 石蕊 40ml蒸馏水 1000ml115灭菌30min1.2.9柠檬酸盐斜面培养基柠檬酸钠 3.0gNH4H2PO4 1.0gMgSO4 0.2gK2HPO4 1.0gNaCl 5.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000ml调PH 至7，加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10ml，培养基呈绿色，分装试管，每管5ml，12130min。1.2.10 含硝酸钾的营养肉汤加入2g硝酸钾入营养肉汤。1.3 主要试剂与溶液(1) 过氧化氢，溴甲酚紫，可溶性淀粉，卢戈氏碘液，甲基红酒精溶液，(2) 脱脂奶粉，硝酸钾，凡士林，石蕊，(3) 溴甲酚紫指示剂：1.6g溴甲酚紫，蒸馏水100ml。卢哥氏碘液：碘1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300ml。精氨酸液：L-精氨酸1.5g，lg/10ml蒸馏水的半胱氨酸溶液0.05ml，蒸馏水 10ml，调pH 7.0，灭菌后备用。奈氏试剂：A液(氢氧化钾20g，蒸馏水50m1)与B液(碘化钾5g，碘化汞10g，蒸馏水50m1)混合后过滤，贮存于暗色瓶内备用。BTB-MR试剂：BTB 0.2g，MR 0.1g，95乙醇300ml，蒸馏水200ml。1.4试验器材载玻片，盖玻片，倒管，试管，培养皿，比色盘。2 试验方法2.1形态和培养特征观察 采用牛肉膏蛋白胨培养基，将已纯化后的甘油菌种活化后于37下培养2024h ，并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法参照微生物鉴定实验指导2.2生长条件试验 (1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7) ;分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。2.3生理生化试验 过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37培养20h24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。葡萄糖产酸产气实验在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。淀粉水解实验接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应甲基红（M.R）试验接种实验细菌于PYG培养基，于37培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。乙酰甲基甲醇V-P实验接种新鲜的实验菌种于PY基础培养基中, 37培养2天后，取培养液1mL在其中加入1ml 10的NaOH，混匀，再加入34滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为V-P阳性。柠檬酸盐取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养37天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性酪素水解试验牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接35株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性(10)厌氧硝酸盐产气接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管，封油的高度约1厘米。必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。观察结果：培养27d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。(11)石蕊牛奶的反应接种新鲜活跃菌种至石蕊牛奶培养基，37，培养l3天后观察结果。牛奶液化表示产酸，为阳性。牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况(12)碳水化合物发酵产酸试验在PY基础培养基中分别加入碳水化合物至最终浓度为1，分装试管，高度为45cm，灭菌后接种，37培养48h，取未加碳水化合物的PY基础培养基做对照，使用BTB-MR试剂指示产酸程度。(13)精氨酸产氨试验接种试验的菌株到含精氨酸的PY培养基中，并同样接种至不含精氨酸的培养基作为对照，37，培养l3天。取已生长好的培养液少许置至比色盘