鼠疫实验室检测技术.ppt

传染病实验室测试技术，传染病实验室测试，病原体本身的生长和繁殖，生理和生化特性测试：传染病细菌染色检查；鼠疫菌培养和鼠疫噬菌体试验；鼠疫的生化检查、营养要求、毒素检测、毒性测定等。病原体特异性抗原结构的检测：传染病F1抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。病原体遗传基因的检测：质粒检测鼠疫菌；鼠疫菌特异性核酸片段的检测；鼠疫菌全基因组测定；插入序列中的测试。第一，鼠疫菌形态检查，典型鼠疫菌短粗，菌体长度1 2米，宽度0.5 0.7米，中等扩张，钝圆，两端钝圆，荚果，鞭毛，豆芽革兰氏染色语音。在被动物、患者及其尸体污染的新鲜器官上制作的压印膜，可以看到两端钝圆、两极浓的典型鼠疫菌。压印标本在吞噬细胞内外可见鼠疫菌，对识别杂细菌污染物很有价值。瘟菌染色法包括革兰染色(菌体染色为红色，黑色素染色严重染色，银丝染色(菌体染色为颜色，胶囊染色为颜色)，鼠疫菌染色检查(长期压印)，黑色素染色，革兰染色，鼠疫染色，鼠疫涂层的革兰染色，鼠疫菌染色鼠疫菌是好氧细菌，同时也是厌氧细菌。鼠疫在普通佩吉生长良好，培养的最佳温度为28，最佳pH为6.9-7.1，发育初期最佳氧化还原电位(Eh)约为100150mV，接种后至少20h能形成肉眼可见的菌落，一般为24 150mv毒性强的鼠疫菌对钙离子具有半依赖性，缺乏时生长不好。在37 缺钙的情况下，强毒性鼠疫菌生长受限，释放大量Yops，分泌强表达和毒蛋白v抗原(LcrV)。这种叫做低钙反应的现象是由70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制的。典型鼠疫菌培养18-20h光学显微镜下透明碎玻璃薄片。培养群体超过24小时，通过光，灰白色稍浅的蓝绿色，在反射光下，群体的圆形隆起为浅灰白色，集落中心为暗黄褐色的粗糙颗粒，周围边缘窄，边缘参差，薄，透明的蕾丝。在鼠疫噬菌体测试中，集中并行噬菌体培养，鼠疫噬菌体落在顶部划线中间，直立板块，噬菌体液体在自然流下垂直交叉，20 培养24小时，有明显的吞噬带。在18 22不分解鼠疫菌，只能分解鼠疫菌的强特异性(吞噬作用具有种特异性)，是传染病细菌诊断的特定识别方法之一。鼠疫噬菌体试验可以快速诊断鼠疫菌。如果在细菌分离培养的同时进行噬菌体降解试验，可以得到20h左右的结果。用传染病噬菌体分离，可以间接判断样品中存在鼠疫菌。鼠疫培养和鼠疫噬菌体测试，典型鼠疫菌落形态，吞噬培养和鼠疫噬菌体测试，鼠疫菌培养特性，鼠疫噬菌体测试，第三，鼠疫F1抗原，抗体检测，鼠疫F1抗原检测1。riha(反血凝试验)2。ELISA(酶联免疫层析)3。胶体金免疫层析(GICA)4。免疫荧光技术(IFT)，传染病F1抗体检测1。间接血凝试验(IHA)2。ELISA(enzyme-linked immuno sorbent immuno sorbent assay)3。胶体金免疫层析(GICA)，间接红细胞凝集试验(IHA)，鼠疫菌，鼠疫菌特异性F1抗原致敏单宁处理的醛量红细胞，F1抗原致敏血细胞制造，传染病特异性F1抗体检测。测试方法和结果的确定是一般工作。IHA微量法结果：用F1抗体感化血细胞，检查传染病特异性F1抗原的反血凝试验(RIHA)。测试方法和结果与IHA相同。RIHA微量法结果：酶联免疫法(ELISA)，抗体测定。双抗原夹心法：添加F1抗原折叠反应板，试验对象标本28 反应1.5h洗涤板，添加HRP-F1抗原28 反应1h洗涤板，基质OPD掩蔽反应30分钟后添加终止液(2毫升/L硫酸)。间接方法：已知F1抗原包反应板，标本37 反应1h洗涤板，酶2段37 反应1h洗涤板，基质(如OPD或TMB)掩蔽反应30分钟后发色结束溶液。肉眼观察结果，各孔的吸光度值(a)，抗原双单克隆抗体夹心法(F1-McAb封装反应板，标本28 反应1.5h洗涤板，HRP-f1 McAb 28 反应1h洗涤板，基质OPD掩蔽反应30分钟后添加终止液。双抗体夹心法(改进方法-美国CDC传染病诊断技术研究所操作手册):传染病免疫血清特异性抗体(F1Ab)封装反应板，标本37反应1h洗涤板，鼠标F1McAb液体371h洗涤板，HRP标记羊抗小鼠IgG37反应1h清洗金标准技术检测各孔的吸光度值(a)、胶体金免疫层析(GICA)、鼠疫特异性抗原、抗体，通过肉眼观察结果，在GICA中得到广泛应用。基本原理都是三明治方法。双抗体夹心法测定抗原：固定在NC膜上的单抗(F1McAb)标本中要测试的抗原(F1Ag)金标记的另一种单抗(黄金标准-F1McAb)颜色。双抗原夹心法测定抗体：在固定于NC膜的传染病F1抗原(F1Ag)标本中，要测试的抗体(F1Ab)黄金标记的F1抗原(黄金标准-F1Ag)着色。三明治法抗体：固定在膜上的传染病F1抗原样本中相应抗体金标记的SPA发色。GICA双抗体夹心法-抗原测定，g区：金牌标准特定抗体(鼠标F1McAb)，C区：绵羊抗小鼠Ig，T区：特定单克隆抗体(F1McAb)，吸水纸，标本，免疫荧光方法：用1%牛血清PBS浸泡5分钟，冲洗固定的幻灯片标本。FITC-FIMcAb适量(0.2ml)荧光染色，在室温作用30分钟后用流水冲洗。干燥、荧光显微镜观察油镜、鼠疫免疫荧光染色荧光染色fluoresccence ypositisitysenasbright、intensegreenstainigaroundthebacterial cell、yersis使用多种PCR方法检测传染病，选定的扩增部位都是鼠疫的特定部位，具有高特异性，能有效地将鼠疫与其他细菌区别开来。传染病PCR反应系统，PCR反应系统(共25l)在使用其他总量时按比例改变以下公式：无菌去离子水13.5l10反应缓冲液2.5l4dNTP混合物(每个2.5毫米)2l引物(1F，1R，2F，2R)每个1l内部控制模板(IC)1l测试对象标本1lTaqDNA聚合酶1l，传染病PCR，然后在95 下1分钟，在55 下1分钟，在72 下1分钟，30循环；最后725min。总共1小时40分钟。电泳：反应管加溴酚蓝指示剂5l，混合短离心。在胶体的每个孔中添加上述处理的反应产物为8l，在80 - 100V (5V/cm以下)电压下，在TBE缓冲液中通电约1小时。结已经我读了结果，拍了照。，多PCR扩增结果，传染病PCR内部控制质粒和EV细菌PCR扩增结果，传染病多PCR多PCR扩增结果，鼠疫菌质粒检测，鼠疫菌3种常见质粒：PPC P1-6 MDA (9.5 kb)编码yersinisPcd1-45m da (70kb)主要编码分泌系统的质粒，即低钙反应，LrcV和一系列yerson细菌特有的Yops表达；表达。Pmt1-65mda (100kb)编码F1抗原和鼠毒素。91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY-length 21742 BP具有独立复制功能，具有编码型分泌系统的基因组。质粒DNA提取-碱分解法和热分解法质粒电泳分析、鼠疫的研究进展、传统病原分类和鉴定方法：病原体的形态特征生长特性(培养特性)A