EV71疫苗质量控制和评价技术要点

EV71疫苗质量控制与评价的技术要点发布于2016年11月16日介绍手足口病(HFMD)是婴幼儿中常见的急性传染病。主要表现为手、脚和口部发热、皮疹或疱疹，并可伴有中枢神经系统症状，如无菌性脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹，甚至死亡。多种肠道病毒感染可导致HFMD。肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)是导致全球HFMD暴发的主要病原体(1)。HFMD约90%的死亡是由EV71感染引起的(2)。EV71引起的HFMD已成为中国的主要公共卫生问题之一。2015年，中国自主研发的EV71灭活疫苗获准上市(3)。研究和制定EV71疫苗质量控制和评价的技术要点，对于规范和提高我国EV71疫苗的质量控制标准和生产一致性，确保疫苗在市场上的安全性、有效性和质量控制具有重要意义。技术要点中的EV71疫苗是指采用传代细胞生产的全病毒灭活疫苗或采用重组DNA技术将具有免疫保护的抗原基因克隆到表达载体上，转化在相应宿主中表达的EV71抗原蛋白，纯化等过程制备的EV71疫苗。本技术要点中与生物制品质量控制相关的所有一般要求，均按照现行版本中华人民共和国药典 (4)的相关规定执行。生产设施要求按中国食品药品监督管理局(CFDA)2010版药品生产质量管理规范 (5)执行。这一技术要点只是EV71疫苗质量控制和评估的指导性文件。它需要根据技术的发展和实际需要进行适当的更新。总则EV71属于小核糖核酸病毒家族，属于肠道病毒属。这是一种无涂层病毒。EV71粒子具有20面对称结构，直径约为24-30纳米，由60个子单元组成。病毒基因组是一条约7400个核苷酸的正链核糖核酸，含有5-UTR区和3-聚腺苷酸尾。EV71的衣壳蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1、VP2和VP3位于病毒衣壳外，VP4位于病毒衣壳内。VP1是EV71的主要表位。EV71只有一个血清型，根据VP1区序列可分为3个基因型A、B、C和11个基因亚型。近年来在台、港等国家或地区流行的主要基因型包括B4、B5、C2、C4和C5亚型(6)，而在mainland China流行的EV71主要是C4亚型。5岁以下儿童和婴儿容易感染EV71 (7)。在后脊髓灰质炎时代，EV71已成为对人类健康最有害的肠道病毒。许多国家或地区的企业和研究机构开发了EV71疫苗，包括全病毒灭活疫苗、基因工程重组蛋白疫苗、减毒活疫苗和多肽疫苗(9)。其中，由中国三家企业研制的EV71灭活疫苗对HFMD EV71感染的保护作用分别为97.4%、94.7%和90.0%(10-12)。2015年12月，CFDA批准中国医学科学院医学生物学研究所和北京科兴生物制品有限公司生产的EV71灭活疫苗上市(3)，为控制EV71感染相关疾病，特别是严重HFMD在中国和世界的爆发和流行提供了手段。近年来，HFMD的流行病原谱发生了变化，由柯萨奇病毒引起的HFMD流行性甲型6型和甲型10型病毒感染呈上升趋势。已经提出了研发用于HMFD预防和控制的多价疫苗的需求(13，14)。基因工程重组蛋白疫苗中的病毒样颗粒(VLP)疫苗具有易于工业化规模生产的优点，并在动物实验中显示出良好的保护效果，表明开发EV71 VLP疫苗(15，16)的可行性。本技术要点侧重于EV71疫苗生产的质量控制和评价，强调生产过程的一致性，并对研发阶段的疫苗提出相关标准和要求，以确保研发和生产阶段的疫苗质量控制和评价方法及标准的趋同。1.PreEV71疫苗的临床前质量控制和评估应根据相关的世界卫生组织(世卫组织)文件和CFDA 预防用疫苗临床前研究技术技术要点及其他技术文件(17-19)进行。新开发疫苗的质量标准应达到或高于所列疫苗的总体质量标准，动物保护试验中疫苗免疫诱导中和抗体的水平和保护效果应与所列疫苗相当。1.1灭活疫苗菌株和细胞基质疫苗生产中病毒株的筛选和确定是灭活疫苗研制成功的关键。应选择主要流行基因型(目前为中国C4型)的病毒作为疫苗候选株进行筛选，重点关注不同株系的交叉保护能力和遗传稳定性。通过比较目前全球流行的毒株(B4、B5、C2、C4、C5等)的保护能力。)和中国不同地区的流行株，和/或构建不同基因亚型的假病毒，选择中和能力强、中和范围广的2-3株作为EV71候选疫苗株。选择在主要免疫原性区域(VP1)具有相同核苷酸序列的菌株进行克隆和纯化，指定世代，建立主要种子批次和工作种子批次。对扩大培养、发酵、收获、纯化和灭活工艺的适应性进行了研究，筛选出工艺适应性和免疫原性较好的候选疫苗株作为疫苗生产菌株。验证项目应包括鉴定试验、病毒滴定、免疫原性、无菌试验、外源因子和遗传稳定性等。各级种子批次的VP1区核苷酸序列不得改变，并具有相似的病毒滴度和免疫原性。根据现行版本中国药典的要求，应建立符合规定的细胞库进行生产。1.2基因工程重组蛋白疫苗株和细胞库选择EV71保护性抗原的基因序列作为构建基因工程重组蛋白疫苗的工程菌株(即生产菌株)的靶基因。目前，已有报道用于EV71疫苗研发的表达系统包括酿酒酵母、汉逊酵母、毕赤酵母和昆虫细胞杆状病毒。在构建过程中，应筛选目标基因完全正确、高表达、遗传稳定性好的克隆作为疫苗生产菌株，建立三级种子体系。应规定主种子批和工作种子批的世代，并进行鉴定试验、不育试验、遗传稳定性、抗原表达水平和免疫原性。其中，汉逊酵母和其他表达系统应决定整合拷贝数；酿酒酵母表达系统需要确定质粒保留率；表达产物应鉴定为目的蛋白，并建立表达量的测定方法和标准。对于昆虫细胞，除满足常规传代细胞系的要求外，还应考虑对昆虫细胞敏感并可能引入的特殊污染病毒或外源因子(如螺原体)，并应建立检测方法和质量控制指标。重组蛋白疫苗与主要流行株和/或假株诱导的中和抗体的中和交叉能力应与灭活疫苗相当。1.3疫苗有效性评估研究表明，用EV71灭活疫苗免疫诱导的中和抗体水平可用作人类免疫保护的替代指标(10，11)。应讨论疫苗免疫不同动物株后诱导的中和抗体反应，应确定合适的动物模型，并应进行疫苗免疫原性验证研究，以获得疫苗诱导的中和抗体反应数据，包括一剂免疫后不同时间的抗体结果、抗体反应和两剂或三剂强化后的结果，以及疫苗的剂量-效果关系。中和抗体通常通过经典的细胞病变效应(CPE)或其他已证实的方法来确定。在验证和相关分析之后可以使用伪病毒方法(20)。中和抗体水平可用滴度来表示，国家标准单位(U)或世界卫生组织单位(IU)被推荐为中和抗体水平标准化单位。免疫原性和保护作用的评价可以选择乳鼠、小鼠和恒河猴作为模型动物。攻击和免疫方法包括母亲对母亲的抗体攻击保护法、母亲免疫后的抗体被动保护攻击实验动物法等。在确定强毒株LD50的基础上，研究获得疫苗动物保护的ED50。可选择所列疫苗作为对照，并可与报告的疫苗乳鼠的ED50保护进行比较，以综合评价疫苗保护效果(21)。评估中应考虑标准品系、标准物质和标准化动物模型等方法的标准化和规范化。1.4疫苗质量特性研究和程序EV71疫苗的质量特性应根据现行版本中国药典的要求进行研究，包括人类疫苗概述、基因重组产品概述及相关技术要点，并结合自身生产工艺的特点。内容应包括理化结构确认、杂质和纯度分析、生物活性研究等。在综合质量特性研究的基础上，建立了疫苗质量标准。EV71的中和表位主要包括位于病毒第五对称轴附近的三个区域：VP1的G-H环、H-I环和VP2的E-F环(22)。对于灭活疫苗，必须关注与市场上已有的疫苗的结构和活性的一致性，包括疫苗中固体(F)和中空(E)颗粒的比例、比活性、诱导中和抗体的能力、动物保护效果等指标；对于基因重组VLP疫苗，需要对VLP蛋白结构进行鉴定和分析，包括用SDS-PAGE或N端测序法测定VLP的分子量和组成，用特异性多克隆抗体或单克隆抗体鉴定抗原基因如VP1表达的靶蛋白，用氨基酸序列分析和肽图谱法鉴定VLP的一级结构。用原子力、透射电子显微镜和动态光散射测量了EV71 VLP的聚集。用结构生物学或免疫学方法分析VLP的保护性结构位点，研究不同条件下抗原结构变化引起的免疫原性降低。应分析VLP疫苗和灭活疫苗的E颗粒结构和免疫原性的相似性，讨论保护位点和灭活疫苗抗原的区别，并比较使用相同蛋白质含量或相同活性单位时免疫原性包括交叉保护能力的差异。灭活疫苗的标准不应低于市场上已有的疫苗。例如，主种子批次和工作种子批次的VP1区的核苷酸序列应与原始种子一致，面积归一化法(高效液相色谱法)计算的EV71抗原颗粒特异性峰的纯度应在95.0%以上，每剂Vero细胞宿主蛋白和残留的DNA不应超过设定的标准等。EV71疫苗原液的F和E颗粒与疫苗的免疫原性有关，F颗粒具有更好的免疫原性(23)。建议在研制灭活疫苗时，考虑建立相应的检测方法，并建立F和E颗粒比例的质量控制标准应考虑建立VLP疫苗株或表达靶蛋白的细胞的鉴定、表达和遗传稳定性的质量控制标准。结构鉴定是VLP疫苗质量控制的重点。在系统鉴定VLP抗原的基础上，应选择和确定科学可行的结构鉴定方法和标准，如周期性N端测序法。建立和验证检测细胞蛋白、核酸成分、添加有机溶剂、疫苗纯度、效力等残留菌株指标的方法，并初步制定相应的标准。应探讨国家EV71疫苗抗原含量和效价测定标准是否适用于所开发的产品，必要时应建立相应的参考或参照。此外，应参照所列重组疫苗和重组治疗性生物制品的相关要求进行质量控制。在疫苗研发过程中，应注意过程控制。工艺优化和验证完成后，EV71疫苗的抗原含量或比活性可作为一致性监测的主要指标，可收集不同批次的试验数据，并可制定疫苗生产中关键质量控制点的抗原含量或比活性的可接受一致性范围。1.5标准物质的研究和应用疫苗质量评价与标准物质密切相关。只有采用统一的标签方法，不同国家或地区的疫苗管理、研发、生产和用户才能在比较疫苗的关键质量指标(如活性或功效)时具有可比性。因此，在疫苗研发阶段应重视疫苗标准物质的建立和应用，以确保质量的一致性和检测结果的准确性。为了评估与临床免疫保护效果相关的疫苗的关键质量属性，例如用于活性或效力测定的标准物质，原则上，它们应该来自可追溯到具有确切保护效果的临床试验的原材料批次。企业应采用已建立的国家EV71疫苗抗原标准、中和抗体标准和疗效标准进行疫苗质量控制和评价。流程优化完成后，一批EV71疫苗抗原可作为后续批次疫苗质量比较的疫苗工作参考物质。对于企业自建的检测方法，应考虑建立相应的工作参考或参考材料。2.疫苗生产的质量控制和评估2.1疫苗生产中的质量控制考虑目前市场上的EV71疫苗是一种纯化的、灭活的EV71全病毒抗原，它是用氢氧化铝佐剂吸附制备的。批准的细胞基质分别是人二倍体细胞和Vero细胞。疫苗生产全过程质量控制的实施，要求对EV71疫苗生产过程中的各个过程环节和所使用的各种原辅材料进行质量控制，并对关键步骤和工艺参数建立控制范围，对关键中间产品建立质量控制指标。根据世界卫生组织和我国疫苗批次发放的相关要求，对EV71疫苗活性成分和杂质的关键质量属性的定量检测数据，以及疫苗质量控制和检测中使用的标准、工作参考和参考材料进行趋势分析，以最大限度地保证疫苗生产批次之间的一致性。在验证EV71疫苗成品的效力时，设定了体内效力和体外相对效力的双重质量控制标准，为将来用体外相对效力替代体内效力提供了依据。2.2疫苗标准物质目前，已建立的国家疫苗标准物质包括：EV71血清中和抗体国家标准、EV71疫苗抗原国家标准和EV71疫苗效力测定国家参考。第一代EV71血清中和抗体国家标准(2010国家标准字0024)是通过冻干和分装健康人血清制备的。它由强阳性(1000U)、弱阳性和阴性质控品组成，用于疫苗诱导中和抗体测定的质量控制2015年，世界卫生组织生物制品标准化专家委员会批准了第一代EV71血清中和抗体国际标准(第一代是抗EV71血清(人)，批号：14/140)，该标准通过冻干和分装健康人血清制备，每份含1000国际单位，用于EV71疫苗诱导中和抗体测定的质量控制。以及低滴度EV71国际参考品(批号：13/238)，300国际单位/支，作为实验对照(27)。目前，EV71疫苗抗原的国际标准正在制定中。建议疫苗生产商根据国家标准建立产品放行和质量控制的参考或控制物质。应注意标准物质校准的可追溯性。2.3生产原料EV71疫苗生产中使用的种子批次、细胞基质、培养基/培养液等原料的质量控制标准应符合现行版本中国药典的相关要求。疫苗应使用批准的工作种子分批生产。病毒滴度应在主种子批次和工作种子批次中确定。疫苗株主要保护蛋白VP1区的核苷酸序列在不同种子批次之间不应改变，以保证遗传稳定性。免疫原性检测标准是用1针程序免疫小鼠，中和抗体的阳性转换率应大于80%。应进行无菌检查、支原体检查和外源性因子检查，确保无细菌、真菌、支原体和外源性因子污染。只有获得批准的细胞