RNA的选择性剪切.ppt

,RNA的选择性剪切,以NRDR的选择性剪切为例,汕头大学医学院,概论,知识背景RNA的剪切修饰RNA的选择性剪切NRDR,知识背景（1）,生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明显差异物种间，脊椎动物的相对应的DNA序列有着惊人的相似。,选择性剪切（alternativesplicing）是物种进化重要方式之一。Neuropsin是一种主要在大脑海马区表达的丝氨酸蛋白酶。该基因同学习和记忆的功能调节以及大脑的发育相关。研究发现，小鼠仅表达TypeI蛋白酶,检测的猕猴、滇金丝猴和长臂猿的大脑中也只表达Type-I。在人的胚胎中，TypeI和TypeII两种剪切方式都有表达，且丰度相似。在成人脑中，TypeII蛋白酶成为优势表达的蛋白酶，TypeI仅有少量表达。研究发现TypeII只在人的大脑中表达。,知识背景（2）,RNA的剪切修饰,Genome,Transcriptome,Proteome,DNA,RNA,Protein,Intergenic,Intergenic,Gene,Exon,Intron,Exon,Exon,Intron,Transcriptionofpre-mRNA,GT,AG,AG,GT,Exon,Exon,Exon,SplicingtomRNA,5,5,5,3,3,3,DonorSite,AcceptorSite,U1,U2,Genome:,Transcriptome:,RNA的剪切修饰,RNA的剪切修饰,过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因体。但以后通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的间断基因为断裂基因。在很多情况下，有内含子的基因首先转录成RNA前体，之后内含子被去除，外显子被拼接到一起。成熟的mRNA只含有外显子序列。我们把内含子的删除过程称为RNA的剪接,通过对mRNA序列与结构基因核苷酸序列的比较，我们可以确定外显子与内含子的接合点。发现，在一个内含子的两端并不存在广泛的相似性或互补性。然而，接点还是具有很好的保守性，尽管只是短短的一致序列。数字指示了特定的碱基在每个一致性位点存在的百分比。结果只在内含子接点上有高一致性序列发现。这样，基因内含子序列就可以定义为：GTAG因为把内含子定义成从双核苷酸GT开始到双核苷酸AG结束，所以接点经常被描述为遵守GT-AG法则，RNA中实际的序列为GU-AG法则。GT-AG法则可以描述许多真核生物核基因中的剪接点。并不适用于线粒体中的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因,RNA的剪切修饰,第一阶段，在内含子5端剪接点形成一个切口，左边的外显子以直线形式存在，右边的内含子一外显子则开成索套（这里内含子5端和内含子内一个碱基形成5-2键，这个目标碱基为腺苷，被称为分枝点）。第二阶段，3端剪接点的剪切从索套形式中释放了内含子，同时，右边的外显子和左边的外显子连接起来。第三阶段，索套随即脱离分枝点，形成一个线性的删除内含子，然后很快被降解。,RNA的剪切修饰,RNA的剪切修饰,RNA的选择性剪切,概念选择性剪切是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择性剪切不仅仅是mRNA剪去内含子的过程，还包括不同外显子之间的组合过程,RNA的选择性剪切,1980年Baltimore在小鼠IgM基因发现第一个选择性剪接现象，不同外显子组合分别产生膜型、分泌型IgM。高通量的基因组测序和EST测序，使生物信息学方法来研究选择性剪接成为可能。最近研究结果显示，约35%60%的人基因有选择性剪接形式。,选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。选择性剪接可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响基因的数量和生物种类范围来看，选择性剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制,RNA的选择性剪切,二单个基因选择性剪接的方式1.内含子的保留；2.可变外显子的保留或切除；3.3和5剪接位点的转移（shift）导致外显子的增长或缩短。,RNA的选择性剪切,pre-mRNA,GT,3,5,AG,三、选择生剪接的功能和生物学意义1.选择性剪接是在RNA水平调控基因表达的机制之一。2.选择性剪接使生物表型具有多样性与复杂性。,RNA的选择性剪切,NRDR的选择性剪切,全反式维甲酸(aRA)通过与其在核内受体结合调节基因的转录来发挥其重要的生理功能，包括正常胚胎的发育，形态、神经系统的形成，成体动物的生长，发育，繁殖等，并通过调节组织及细胞的分化来促使一些恶性肿瘤向良性转变。临床上我国科学家率先将aRA用于急性早幼粒细胞白血病的治疗并取得了良好的疗效。aRA在体内是由维生素A也称视黄醇(Retinol)经两步代谢而成，中间代谢产物为视黄醛(Retinal)，即RetinolRetinalaRA,NRDR的选择性剪切,已有不同组织的多种酶被认为参与这两步代谢过程。辅酶II依赖性视黄醇脱氢酶(NADP-dependentretinoldehydrogenase/reductase，NRDR)是由黄东阳教授在兔肝细胞中纯化的一种新酶，NRDR普遍存在于哺乳动物肝中，显示出较强的Retinol氧化与Retinal还原活性。兔、小鼠、人与牛肝脏NRDRcDNA全长已相继被克隆（GenBank登录号为AB045133，AB045132，AB045131，AF487454），这些NRDR的C-末端都有过氧化物酶体定位信号-SRL，属于短链脱氢酶/还原酶家族（SDR）。预测这些cDNA编码区序列（ORF），发现它们均有两个ORF，分别编码278与260个氨基酸，后者符合Kozak序列。,NRDR的选择性剪切,人NRDR基因位于14号染色体长臂(14q11.2,LOCUSNT_025892)，被命名为DHRS4，由3个外显子簇（clusters），共97634碱基组成。Cluster1是人与哺乳动物共有的保守序列，含有构成NRDR的8个外显子，Cluster2含有8个，Cluster3含有7个相对应的外显子。,人DHRS4基因结构、NRDR及其选择性剪切亚型的构造特点,NRDR的选择性剪切亚型,最近，在人宫颈癌细胞、肝癌细胞及食管癌细胞中均发现新的NRDR剪切亚型。近年来，选择性剪切对于蛋白质多样性及其与肿瘤的相关性引发人们关注。作为参与合成、调节aRA的NRDR，出现不同形式的剪切亚型，是否与肿瘤的发生有相关性，值得深入研究。,NRDR的选择性剪切亚型,一NRDR选择性剪切亚型的克隆1.提取细胞总RNA:Trizol法提取Hela,BELT,EC7-9706总RNA2.逆转录为cDNA3.PCR扩增：NRDRsense:5-tccaccgacgggatcggctt-3NRDRantisense:5-atgccagcacaatcctctggct-3NRDRisosense:5-atggccagctccgggatga-3NRDRisoantisense:5-tcagaggcgggacggggtt-34.胶回收：PCR产物纯化5.连接至质粒载体：pGEM-Teasy载体6.转化至感受态大肠杆菌（JM109）7.重组子筛选（蓝白筛选）8.细菌扩大培养9.提质粒10.测序,NRDR的选择性剪切亚型,二选择性剪切亚型全长cDNA的克隆Invitrogen3RACE试剂盒cDNA合成引物:5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3FirstPCRsense:5-tccaccgacgggatcggctt3AUAP:5-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3NestedPCRsense:5-tggtggccacgactctggacat-3AUAP:5-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3Invitrogen5RACE试剂盒cDNA合成引物：5-GCAGGAATCCCGAGT-3FirstPCRAAP:5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3antisense:5-tcttatccgcagggtttcttt-3NestedPCRAUAP:5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3antisense:5-catccagagaggagatggactg-3,NRDR的选择性剪切亚型,三选择性剪切亚型的细胞内定位将新的选择性剪切亚型基因与水母绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，在哺乳动物细胞中表达，并用相应的抗体及荧光标记二抗进一步确认其在细胞内的位置。四新的选择性剪切亚型的体外重组表达原核表达，真核表达蛋白经分离、纯化后，测定其功能五制备抗体，检测肿瘤组织中新亚型的蛋白表达,NRDR的选择性剪切亚型,Hela,BELT,EC9706细胞株中发现新的剪切亚型,NRDR的选择性剪切亚型,NRDR的选择性剪切亚型,NRDR的选择性剪切亚型,NRDR的选择性剪切亚型,预测新剪切亚型蛋白仍保留了部分SDR结构功能域，在20-27位氨基酸(TASTDGIG)保留了