G6PD缺乏症设计性实验.ppt

设计性实验,初步判断,1天前食用新鲜蚕豆据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况遗传性,恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白脉搏150次/分，血压80/60mmHg，血压下降，呼吸40次/分，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，尿蛋白（+）。,G6PD缺乏症临床表现,正常.红细胞数4.05.51012/L，血红蛋白120160g/L患者.红细胞1.981012/L，血红蛋白53g/L正常.血清总胆红素1.7117.7mol/L结合胆红素1.76.8mol/L，未结合胆红素10.266.84mol/L患者.溶血清总胆红素85.5mol/L结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，皮肤及巩膜黄染(溶血性黄疸）,急性溶血的证据,半个月内有食新鲜蚕豆史,急性溶血的证据,G6PD缺乏症临床表现,遗传性：患者姐姐曾有此情况,诊断依据,明确诊断.G6PD缺乏之检测实验.,G6PD检测实验,实验方法:G6PD比值法主要试剂：抗凝全血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）、终止液、试管、移液器主要仪器：752分光光度计、水浴箱,终止液：是一种阻止（生化试剂）化学反应继续进行的一种试剂，例如ELISA酶联免疫实验结果出来后由于显色剂和残留酶标液作用，反应还在继续进行中，会影响实验结果数值，就需要终止液的作用了。终止液一般用强酸或者强碱做主要配方，常用的终止液一般为2mHCl和2mH2SO4。,.实验原理.,人红细胞戊糖代谢的关健酶G6PD催化G6P转化成6PG时，伴有NADP转化成还原型辅酶II（NADPH）。因此测试NADPH的量反映了G6PD活性。但单测G6PD活性不能排出其他原因引起的G6PD活性升高或降低（如红细胞增多症，标本吸量不准确，贫血，标本溶血，凝血，陈旧，污染等）。测试红细胞戊糖代谢的另一同功酶6PGD，有将NADP转化成NADPH的作用，通过两酶活性比值计算G6PD/6PGD，可判断G6PD是否缺乏。,实验操作流程1、取抗凝全血15l，加入双蒸水200l制成溶血液。分别取溶血液50l加入1,2号试管中2、取G6PD和6PGD反应试剂各50l，分别加入1,2号试管中，混匀，立即置37水浴箱准确保温20min3、取出试管，立即加入终止液2ml，以蒸馏水作为空白对照，于650nm波长读取1，2管的光密度值（S1和S2）4、比值计算：G6PD/6PGD=S1/S25、正常参考值：1.02.3,注意事项：准确设置水浴箱温度，温度过高会破坏酶的活性，影响实验结果取出试管后要立即加入终止液，否则反应继续会影响实验数据结果分析：G6PD/6PGD=S1/S2，正常参考值：1.02.3，比值1.0判为G6PD缺乏。,从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果：蚕豆病患者在食用蚕豆后会出现中毒症状，出现恶心、呕吐由于红细胞破裂，运氧供养障碍，导致呼吸急促，脉搏微弱而快速；血压降低,从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果：,临床表现：面色苍白，血尿,恶心呕吐，排尿呈酱油样色，呼吸急促，神清，萎靡，皮肤及巩膜黄染,实验室检查：红细胞1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。,利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基因位点。,正常参值：红细胞数4.05.51012/L，血红蛋白110160g/L，而此时红细胞破裂产生全身溶血性反应，红细胞大量破裂释放出血红蛋白，因此患者红细胞为1.981012/L，有明显下降；由于红细胞破裂，血浆游离血红蛋白显著增高，超过结合珠蛋白的量和肾小管再吸收功能，出现酱油色的血红蛋白尿，而血红蛋白53g/L，降低红细胞大量破坏，在单核-吞噬细胞系统产生胆红素过多，超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆红素的能力，造成血液中未结合胆红素浓度明显增高，发生溶血性黄疸,皮肤及巩膜黄染，尿胆红素()。肝对胆红素的摄取、转化、排泄增多，过多胆红素进入胆道系统，肠肝循环增多，使得尿中尿胆原和尿胆素含量增多，故尿胆素原(+),要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？可以利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基因位点。由于G-6PD基因位点缺乏的多态性,逐个基因位点测序,工作量大,有一定盲目性,选择疑有突变位点基因测序显得尤为重要,采用PCR-SSCP技术筛选带有突变的基因位点测序为一较好的研究方法。通过基因测序了解G-6PD缺乏症发生的分子基础,对于遗传性酶缺陷的基因研究及治疗提供理论依据具有重要意义。