第二十章 常用分子生物学技术的原理及应用改

第二十章,常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication,第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology,分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性（见第二章）印迹技术探针技术,核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)利用DNA变性与复性这一基本性质来进行DNA或RNA定性或定量分析的一种技术。,一、分子杂交与印迹技术的原理,第二节,聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction（PCR）,一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术,PCR可以把指定的基因片段数量放大百万倍,染色体,Mullis(1993),一、基本工作原理,以待扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3和5端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。,（一）PCR体系基本组成成分,含Mg2+的缓冲液,dNTP,耐热DNA聚合酶TagDNA聚合酶,特异性引物一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。,模板DNA,（二）PCR基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,循环2530次,使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除,使引物和模板DNA退火结合,此温度下DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA链的延长,三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环,第一轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,DNA-Pol,DNA-Pol,温度,第二轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循环,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循环,第二次循环,第三次循环,第四次循环,PCR的主要用途,PCR的用途,基因突变检测,基因的体外突变,目的基因的扩增,DNA序列测定,微量的DNA和RNA分析,第三节基因文库（GeneLibrary）,基因文库包括：基因组DNA文库cDNA文库,基因文库：是指包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,一、基因组DNA文库,以DNA片段的形式储存在某一生物的全部基因组DNA信息。包括所有的编码区和非编码区。文库中包含的噬菌体克隆数代表基因组DNA片段的种类数。人基因组DNA文库的噬菌体克隆数应在106以上才能包含该基因组99%的DNA序列。基因组文库的形式是一群含有某细胞DNA不同片段的噬菌体。,二、cDNA文库,包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经过反转录合成的cDNA序列的克隆群体。它以cDNA片段的形式储存着该组织细胞的基因表达信息。cDNA文库的容量要足够大，要求克隆数在106以上才可能包含来自细胞内低丰度的mRNA信息。,三、基因文库的构建与筛选,DNA片段插入载体,重组载体感染宿主菌,限制性内切酶裂解,反转录合成cDNA再合成双链cDNA,基因组DNA,mRNA,cDNA文库,基因组文库,探针杂交选取阳性克隆，获得目的基因,细胞,质粒噬菌体,噬菌体粘粒酵母人工染色体,20kb左右,目的基因的筛选,从基因组文库中筛选目的基因可采用核酸分子杂交,用放射性核素标记已知序列的DNA片段,标记片段与基因组文库中所有克隆杂交,放射自显影选出阳性