第9章-DNA序列分析.ppt

第9章DNA序列分析，第1节Maxam-Gilbert化学分解法第2节Sanger链终止法第3节DNA片段序列测定的战略第4节DNA片段序列的生物信息分析，DNA序列分析(DNAsequencing，或DNA序列分析)是分析特定DNA片段的碱基序列，即确定DNA双链上各个独立结构单元或碱的正确顺序。 正确测定DNA序列是进行基因结构和功能分析、在基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。 同时DNA测序技术为快速、简单地分析蛋白质序列和结构提供了工具。 DNA测序的发展： 1953年，Watson和Crick导出了DNA双螺旋结构，Whitfeld发明了化学分解测序法，1972年，Berg开发了DNA重组技术，1975年，Sanger是加减法测序法Sanger发明双脱氧序列法的1986年，出现了第一个半自动序列仪，2000年，Drosophila解读了全基因组序列。 DNA序列的测定有桑格双脱氧链的终止法和maxam-gilbert化学分解法。 20实际上在80年代中期，出现了序列发生器。 发展以来，自动测序已成为目前DNA序列分析的主流。 美国peabi公司生产373型、377型、310型、3700型、3100型等DNA序列仪，其中310型是临床检查实验室使用最多的型号。 第一种测序技术的测序技术可以首先追溯到20世纪50年代，1954年已经出现了关于初始测序技术的报道，Whitfeld等人用化学分解的方法测定多核苷酸序列。 第一代测序技术诞生的1977年Sanger等人发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等人发明的化学分解法，标志着第一代测序技术的诞生。 随后，基于Sanger法，80年代中期出现了荧光标记代替放射性同位素标记，荧光信号接收机和计算机信号分析系统代替放射性自显影。 另外，90年代中期出现的毛细管电泳技术大幅度提高了测序通量。 此外，在这个时期，还可以使用焦磷酸序列法(pyrosequencing )、合成序列法(sequencingbyligation，SBL )、杂交序列法(sequencingbyhybr 第二代自动测序技术已经完成了从噬菌体基因组到人基因组草图的大量测序，但由于成本高、速度慢等方面不足，并不是理想的测序方法。 经过不断的开发和测试，进入21世纪后，象征Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术的第二代测序技术诞生了。 第二代定序技术不仅与第一代技术相比维持了高精度，而且大幅度降低了定序成本，大幅度提高了定序速度。 使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划，花费了30亿美元的巨额资金，花了3年时间，而使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序只需要一周左右。 第二代测序技术由于测序结果的长度短，适合重新排列已知序列的基因组，在排列新的基因组时需要结合第一代测序技术。 第三代基因组序列分析技术实现单分子速读的自然杂志网站，2月8日在美国佛罗里达州马可岛召开的“基因组生物学和技术进展大会”上，由加利福尼亚州门洛帕克市太平洋生物科学技术公司(PacificBiosciences )开发的第三代基因组序列序列测定的技术、混合序列分析法单分子序列分析法原子探测显微镜序列分析法DNA芯片法、经典方法：Sanger双重脱氧链停止法(Sanger，1977)Maxam-GilbertDNA化学分解法(MaxamGilbert，1977 )、新技术的方法33 第一节Maxam-Gilbert化学分解法化学分解法：用特异性作用于a、t、g、c碱的化学药剂分别处理被内切酶切断的一定长度的DNA片段，控制反应时间，分别以a、t、g、c结束的4组可能长度的核苷酸除了采用研究DNA的高级结构、与DNA蛋白质结构的关联性的化学分解法之外，在单纯以决定序列为目的的实验中，一般采用后述的酶合成促进法。 碱基特异性化学切断反应：硫酸二甲基(DMS ) :将DNA分子中鸟嘌呤(g )上的N7原子甲基化。 肼：切断DNA分子中胸腺嘧啶(t )和胞嘧啶(c )的嘧啶环； 但是，在高盐条件下，只有c断了，不与t反应。 哌啶：从修饰甲基中切断核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐、低盐条件下，3种化学试剂可以不同组合特异地切断核苷酸序列中的特定碱。 g反应： DMS使g在中性和高温下脱落。 G A反应：酸性条件(甲酸等)使a和g嘌呤环上的n原子质子化，利用哌啶使a、g脱落。 T C反应：肼(低盐) c反应：肼(高盐)测定了DNA长度250bp。 化学降解法测定DNA核苷酸序列，第二节Sanger链终止法，1977年Sanger设计了通过DNA复制识别4种碱基的方法，进行了DNA序列的测定，即双脱氧链终止法。 Sanger法获得了诺贝尔化学奖。 另一方面，Sanger的双脱氧链终止法的原理是在模板的指导下，DNA聚合酶在引物的3oh末端加入dNTP，延长引物，合成新的互补DNA链，加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP )， 由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，无法与后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成具有相同的5引物末端和ddNMP残基为3末端的一系列长片段的混合物。 因为每个DNA分子导入双脱氧核苷酸的位置不同，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，区分长度不同的核苷酸的单链DNA，读取DNA核苷酸序列。 和PCR反应相似。 反应体系中含有模板DNA、Taq酶、dNTPs、ddNTPs和测序引物的反应过程：变性-恢复性-伸展-终止、Sanger双重脱氧终止法、Dideoxynucleotides (双重脱氧核苷酸)、ddNTPs是反应终止剂反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs (一般为34:1 )。*，1个-OH，脱氧核酸和双脱氧核酸的结构比较，h，2， 双脱氧终止法测序反应体系：DNA聚合酶的单链DNA模板中，有3-OH末端的单链寡核苷酸引物mg2的4种dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dttp )的4种ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP 有Sanger法DNA测序的试剂引物：通常由20-23个碱基构成，在G C=12、ATT=811、Tm=60-68下，避免引物二聚体的形成和发夹状结构的形成模板DNA聚合酶、 3dideoxynucleosidetosphate DD NTP )dntp 3、测序反应的种类引物标记法(Dyeprimerreactions)终止物标记法(Dyeterminatorreactions ) thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide (noticethehatomattachedtothe3carbon ) . alsodedpicitditinthisfireartheingredientsforasangerreaction.notecisthedifferentedlengthsoflabeledstranddsproductdinthisreac thisfigureisirepresetationopoptationofanacrylamidesequencegel.noticethatthesequencefthestrandoddacomplementationthescreatione cc GATT whilethesequenceofthesequencedstrand，5to3， isAATCTGGGCTACTCGGGCGT定序过程：1 .模具和引物杂交2 .引物的延长和合成阻断四个试管分别是ddA、ddG、ddC， PS四个试管中的所有产物都是一系列长度仅为一个核苷酸的聚合链3 .电泳： ACGT序列，高压电泳4 .放射线自显影直读图像Sanger的第一步：复制中止剂，荧光检测探针，电泳，看谁跑得快Sanger法测定序列产物的平均链长取决于ddNTP和dNTP的比率，比率高时，得到短的产物，gelectrophoresisdnafragmentsizedetermination，DNA带负电的DNA在电泳凝胶中的迁移率为其片段、DNA片段序列测定策略、测定未知序列的DNA片段的一次序列测定结果有长度限制(1111 但是，在测量下一个序列之前，必须知道上游序列的碱基顺序，所以可以合成适当的引物来确定序列。 定向缺失克隆策略、染色体步进法等。、鸟枪序列确定方法：随机中断要测定的DNA片段，构建随机重叠克隆库，然后使用通用引物测定各克隆的DNA序列当这些测定序列的数量达到某种程度时，还测定了与所测定的DNA片段的各部位相当的序列，根据这些测定序列间的重复部分，最终能够将DNA片段整体的序列连接起来的序列决定策略称为随机克隆序列决定。 将DNA的大片段切成小片段的3种方法：限制性内切酶用超声波处理DNA酶I的分解(加Mn2 )，鸟枪法测序的缺点是，随着所测基因组总量的增加，所需测序的片段会大量增加，引起反复测定，部分序列高等真核生物(如人)的基因组中有大量的反复序列，会导致判断错误。完全基因组测序过程一般包括以下三个步骤： (1)克隆物理图像：酵母人工染色体yac(yeastartificchroome )克隆、细菌人工染色体bac(bacteralartificchroome )克隆等； (2)利用鸟枪法测定每个克隆的序列(3)序列的拼写和注释：获得DNA序列后，可以利用序列分析工具进行序列的拼接，接着通过与数据库序列的比较基因组序列解析：，DNA的全部序列，结合短语和向量进行序列解析，Sequenceoverlappingfragments，Assembledsequence，基因组DNA序列测定图像是随机的制作这些重叠片段的图像，对重叠片段进行排序，通过“组合”得到基因组序列。 另一种方法不是根据片段染色体的位置，而是根据其重叠部分进行“拼盘”。sequenceeallfragmentsandassemble，四、大规模DNA排序的趋势-自动化、DNA排序实现大规模化的重要条件是自动化和机械化。 目前，DNA的制造、克隆文库的建立和筛选、DNA序列分析、数据的分析获得、碱基序列的读取、重复克隆群的排序等过程正在平行发展，自动化操作随后发生。 随着DNA序列从半自动化转变为自动化，原始数据的积累没有问题，重要的是组装全基因序列，实现DNA序列的完整性。 目前，在子克隆的筛选、模板的制作、测序反应、碱基阅读等方面已实现了一定程度的自动化。 1、克隆的筛选逐渐自动化了从克隆中寻找和筛选单个克隆。 2 .模板创建现有机器人自动分离DNA，创建适合传统操作的序列确定模板。 也采用了特定用途的DNA分离器。 3、定序反应不能保证手动定序所需的再生能力、高吞吐量和正确的再现性，因此DNA定序反应的自动化对大规模定序来说非常重要。 4、自动放射性显影读书机近年来陆续上市，向商业化和科学研究的应用方向发展。 5、自动序列仪DNA自动序列仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基读取等步骤的自动化。 310型全自动遗传分析装置，DNA全自动分析装置：ABIPrism3100遗传分析装置，3700型全自动遗传分析装置，马来西亚DNA序列分析系统模型： MegaBACE500/1000/4000，分析装置的新开发：377型遗传分析装置3730型遗传分析装置， 377型DNA全自动分析仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合应用美国生物系统(ABI )公司专利的四色荧光标记、激光检测、泳道检测方法，一个测序反应保证500bp的正确序列。 3730型DNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度快、效果好、通量大，一个测序反应保证了800bp的正确序列，是目前基因测序的主力。 优点： I.4个反应系统可以合并点样，可以大幅度节省制糊和点样时间ii .可以同时读出