顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验_秦晓黎

第30卷第1期 2009年1月 中山大学学报（医学科学版） JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES） Vol30No1 Jan2009 顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验 秦晓黎， 金平， 靳荣 （兰州大学第一医院妇产科， 甘肃 兰州730000） 摘要： 【目的】 研究顺铂（DDP）、洛铂（LBP）、紫杉醇（PTX）、吉西他滨（GEM）对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3 DDP细胞增殖的影响。 【方法】 培养基中不含药物的处理组为对照组，加入不同浓度化疗药物的处理组为实验组。 在相差显 微镜下观察细胞形态变化；用MTT法测定单药应用、双药联合使用对两种细胞生长的影响；流式细胞仪分析细胞周期和凋亡 率的变化。 【结果】SKOV3DDP细胞耐药指数为710 219。 紫杉醇、洛铂、吉西他滨对两种细胞的抑制率无明显差别。 洛 铂、紫杉醇、吉西他滨两药联合组与相应单一用药组相比，能显著抑制肿瘤细胞的生长，其中吉西他滨洛铂及紫杉醇洛 铂组抑制率明显增高。 相同浓度顺铂作用48 h 后， SKOV3DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞。 洛铂、紫杉醇、吉西他滨作 用两种细胞48 h后，细胞凋亡率差异无统计学意义。 顺铂、洛铂与紫杉醇、吉西他滨主要作用于不同的细胞周期。 【结论】 SKOV3DDP细胞对紫杉醇、洛铂、吉西他滨无交叉耐药。 联合用药有高效协同抑制细胞生长作用，临床治疗卵巢癌顺铂耐药 患者可考虑选择吉西他滨洛铂、紫杉醇洛铂联合化疗。 关键词： 卵巢癌； 顺铂耐药； 化疗敏感性 中图分类号：R7336 文献标识码：A文章编号：16723554（2009）01008206 Experimental Study of Chemosensitivity of Human Ovarian Cancer Cisplatin-resistant Cells QIN Xiao-li，JIN Ping，JIN Rong （Department of Obstetrics and Gynecology，The First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China） Abstract： 【Objective】To observe the effect of cisplatin（DDP），lobaplatin（LBP），paclitaxel（PTX）and gemcitabine （GEM）on cell proliferation of human ovarian cancer cell line SKOV3 and its cisplatin-resistant cell line SKOV3DDP in vitro 【Methods】Cultured SKOV3 and SKOV3DDP cells were treated by chemotherapeutics with different concentrations and at different timeControl group was treated with nothing；experimental group was incubated with drugsTheir morphological changes were observed under a phase contrast microscopeMethyl thiazolyl tetrazolium（MTT）colorimetric assay was used to detect the differences between the two cells for their sensitivity to chemotherapeutic drugs The cell cycle and apoptosis rate were measured by flow cytometry【Results】The resistance index of SKOV3DDP cells was（710 219） Lobaplatin，paclitaxel and gemcitabine had no significant differences in influencing the cell growth inhibitory rate of both SKOV3 and SKOV3DDP cellsCombination of two chemotherapeutic drugs produced significant anti-proliferation effects on tumor cell growth inhibition when compared with using single drugLobaplatin in combination with gemcitabine or paclitaxel had more inhibitory effects on the cellsFlow cytometry analysis showed that the apoptosis percentage in SKOV3DDP cells was significantly lower than that in SKOV3 cells after cisplatin treatment for 48hThere was no significant difference in cell apoptotic rate between the two cells after incubation with lobaplatin， paclitaxel and gemcitabine for 48 hCisplatin，lobaplatin，paclitaxel，and gemcitabine influenced the cell cycle in different phases【Conclusions】Ovarian cancer SKOV3 DDP cells show no sensitivity to cisplatin but they were non-cross-resistant to lobaplatin，paclitaxel and gemcitabineThe combined treatments of drugs in chemotherapy can synergistically inhibit the proliferation of cellsIt is probably to choose gemcitabine and lobaplatin or paclitaxel plus lobaplatin for the treatment of cisplatin- resistance in ovarian cancer patients Key words：ovarian neoplasm；cisplatin-resistant；chemosensitivity J SUN Yat-sen Univ（Med Sci），2009，30（1）：8287 收稿日期：20080525 基金项目：兰州大学医学科研基金（LZVYX200719） 作者简介：秦晓黎，研究生，主治医师，研究方向：妇科肿瘤，E-mail：qinxl06lzucn DOI:10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2009.0021 第1期 卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威 胁妇女的健康。 超过70的患者发现时已为晚 期1，5年生存率约452。 卵巢癌的治疗包括化 疗、手术治疗、放疗。 此外，其他的一些治疗方法包 括基因治疗3、血管生成抑制剂治疗4、调控细胞 信号转导5、免疫治疗6等，但疗效尚不确切。 化疗 在卵巢癌治疗中居有重要的地位， 除极少数早期 癌可以单纯手术治愈外，均需辅助化疗。 近10年 来， 铂类联合紫杉醇是治疗卵巢癌的标准一线化 疗方案。 尽管化疗初治患者缓解率可达到807， 但多数卵巢癌患者仍会复发， 其主要原因是化疗 过程中卵巢癌细胞对化疗药物的原发性和（或）继 发性耐药并导致患者预后不良89。 临床上一直在 研究使用不同的化疗药物及联合化疗方案， 以期 提高卵巢癌患者的生存期及生活质量。 本研究通 过对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3DDP 细胞进行体外药敏实验， 对药物干预后的细胞增 殖情况进行研究， 为临床选择治疗方案提供实验 依据。 1材料与方法 11实验材料 111细胞株SKOV3为卵巢浆液性乳头状囊腺 癌细胞株，购自上海中国科学院细胞库。SKOV3 DDP为SKOV3顺铂耐药株，购自中国医学科学院 肿瘤医院。 122药物及试剂胎牛血清 （四季青公司）， McCOYS 5A（Sigma公 司 ），RPMI1640培 养 基 （Gibco公司）， 四甲基偶氮唑盐 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（Sigma公司），顺铂 粉剂 （cisplatin，DDP），购自山东齐鲁制药有限公 司，10 mg 支；洛铂（lobaplatin， LBP）， 购自海南 长 安 国 际 制 药 有 限 公 司 ，50 mg支 ； 紫 杉 醇 （paclitaxe，PTX）购自哈尔滨三联药业有限公司， 30 mg支；吉西他滨（gemcitabine，GEM），购自哈 尔滨誉衡药业有限公司，200 mg支。 使用时新鲜 配制，使最终浓度分别为：顺铂05、1、2、3、4、5 g mL；洛铂2、4、8、16、32 gmL；紫杉醇1、2、3、4、5 gmL；吉西他滨10、20、40、80、100 gmL。 联合 用药时浓度：洛铂4 gmL；紫杉醇3 gmL；吉 西他滨100 gmL。SKOV3细胞顺铂浓度03 g mL；SKOV3DDP细胞顺铂浓度2 gmL。 12方法 121细胞培养SKOV3细胞用含100 mLL胎 牛血清的McCOYS 5A培养液，在37 、体积分数 5CO2条件下培养；SKOV3DDP细胞用含100 mLL胎牛血清RPMI1640培养液培养。 122形态学观察浓度为5 104mL的SKOV3、 SKOV3DDP细胞悬液接种于6孔培养板中，每孔 5 mL，过夜贴壁，第二天更换培养液，加入化疗药 物培养48 h，倒置显微镜下观察。 123细胞生长抑制率的测定取对数生长期细 胞（5 104mL ），接种于96孔板，每孔加入不同 浓度的化疗药物， 空白对照组加等体积不含药物 培养液，每组设5个平行孔，每种药物接种3板， 此后分别在加药后24、48、72 h取出一板，每孔加 入5 gL MTT 10 L，继续培养4 h，吸去培养液， 加入二甲基亚砜100 uL， 微震荡后， 用酶标仪在 490 nm波长下测光吸收值（A），计算抑制率（） （1实验组A对照组A） 100。 本实验重复3次。 用软件计算半数抑制浓度（50 growth-inhibition， IC50），耐药指数（resistance index，RI）耐药细胞 IC50亲本细胞IC50。 用金正均法判断两药合用是 否具有协同作用。 公式：qEa b（Ea EbEa Eb）， 公式中Eab为两药合用的抑制率，Ea、Eb 分别为单用的抑制率。 若q值在085 115间为 两药作用相加，q 115为协同作用，q 085表示 两药相互拮抗。 124流式细胞术收集不同浓度化疗药物作用 48 h的细胞，磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS） 洗涤后用4 700 mLL乙醇固定12 h以上，经离心去乙醇，碘化丙啶染色30 min后上 机检测。 每组重复3次。 13统计学方法 采用SPSS115统计学软件。 实验数据用xs 表示， 多样本均数比较采用单因素方差分析，两 组均数比较采用成组设计的t检验，分析时间浓 度效应用析因设计的方差分析。 检验水准a 005。 2结果 21形态学改变 SKOV3细胞呈长梭形，SKOV3DDP细胞呈 多边形。 两种细胞均为贴壁细胞，轮廓清楚，形态 秦晓黎，等顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验 83 中山大学学报（医学科学版） 第30卷 饱满，胞质丰富，生长旺盛。 化疗药物处理后，贴壁 的正常细胞数逐渐减少，细胞间距变大，部分细胞 体积缩小，胞浆中出现颗粒沉积，折光性减弱。 随 时间延长，脱落漂浮的细胞增多，可见坏死细胞 及碎片。顺铂作用两种细胞48 h后形态学变化见 图1。 ABCD EFGH 图1SKOV3细胞与SKOV3DDP细胞形态变化 Fig1Morphological changes of SKOV3 and SKOV3DDP cells A，B：SKOV3 cells；C，D：SKOV3 cells treated with 07 gmL cisplatin；E，F：SKOV3DDP cells；G，H：SKOV3DDP cells treated with 5 gmL cisplatin； （200，400） 表1顺铂作用48 h对细胞的抑制活性 Table 1Inhibitive effects of cisplatin on the cell proliferation Group SKOV3 SKOV3 DDP 05 465 21 88 161） 1 533 29 104 091） 2 629 17 240 241） 3 655 09 350 181） 4 705 20 412 291） 5 718 20 581 161） DDP（gmL） 1）P005，vs SKOV3 group 22顺铂、洛铂、紫杉醇、吉西他滨对细胞的杀伤 活性 MTT结果为3次实验平均值。 不同浓度化疗 药物作用24、48、72 h后，各用药组光吸收值均明 显低于空白对照组，有统计学意义（P 005）。 相 同浓度顺铂作用48 h后， 两种细胞抑制率不同， SKOV3细胞抑制率高， 两组相比差异有显著性 （P 005）（见表1）。计算48 h顺铂对SKOV3细胞 IC50为（070 012）gmL，对SKOV3DDP细胞 IC50为（497 101）gmL，RI 710 219。 相同 浓度的洛铂、吉西他滨、紫杉醇作用两种细胞相同 时间后，细胞抑制率差异无统计学意义（P005）。 在同一药物浓度下， 细胞抑制率随作用时间的延 长有增加趋势； 化疗药物对两种细胞的的抑制作 用随浓度增加而增强。 当浓度达到一定程度时，抑 制作用已接近最大，继续增加浓度，抑制率并无明 显增强。 用光吸收值做析因分析得出化疗药物浓 度与时间存在交互作用（P 005）。 23顺铂、洛铂、紫杉醇、吉西他滨联合用药对细 胞的杀伤活性 两药联用的增殖抑制率随时间延长而增加。 与空白对照组光吸收值比较， 吉西他滨洛铂及 紫杉醇洛铂组抑制作用更明显（P001）。 联合 用药组与相应单一用药组相比细胞抑制率差异有 显著性（P005）。 金正均法检测显示洛铂、紫杉 醇、吉西他滨两药联合用作用两种细胞，各时间点 q值均115，说明两种药物合用起到了显著的协 同作用。 紫杉醇顺铂及吉西他滨顺铂作用于两 种细胞，两种细胞抑制率不同，SKOV3细胞抑制率 高，两组相比差异有显著性（P005 ；表 2）。 84 第1期 图2顺铂诱导SKOV3DDP细胞细胞凋亡 Fig2Effect of cisplatin on apoptosis of SKOV3DDP cells observed by flow cytometry A：before treatment；B：48 h after being treated with 5 gmL cisplatin 表2联合用药对细胞的抑制活性 Table 2Effects of two-drug combinations on the proliferation of the cells Group GEM LBP PTX LBP GEM PTX PTX DDP GEM DDP SKOV3 460 23 440 25 352 30 337 28 314 20 SKOV3 DDP 439 13 420 23 292 30 230 181） 222 241） SKOV3 650 29 637 24 546 30 514 23 538 19 SKOV3DDP 660 24 631 33 516 28 406 301） 382 191） SKOV3 733 28 713 22 601 31 630 26 604 18 SKOV3 DDP 726 29 715 22 616 19 516 161） 49 8 241） 24 h48 h72 h 1）P005，vs SKOV3 group 24细胞周期的变化与凋亡率 不同浓度化疗药物作用两种细胞48 h后，细 胞周期发生变化。 顺铂、洛铂作用于两种细胞后， 与对照组比较，随着药物浓度增加，G0 G1期比例 增高，G2 M期比例变化不定，表明细胞阻滞于 G0 G1期，细胞增值活动受到抑制。 紫杉醇作用后， 表现为G2 M期阻滞，S期细胞明显减少。 吉西他 滨组G0 G1期细胞明显减少， 而S期细胞明显增 加。 用药组在G0 G1峰前均出现一个DNA含量 减少细胞凋亡峰（Ap峰）。 随药物浓度增加，凋亡 率逐渐增加， 各用药组细胞凋亡率均高于空白对 照组（P 005）。 相同浓度顺铂作用48 h 后，两种 细胞凋亡率不同，SKOV3细胞凋亡率高，两组相比 差异有显著性（P 005）。 见表3。 相同浓度洛铂、 紫杉醇、吉西他滨作用后，两种细胞凋亡率差异不 明显，无统计学意义（P 005）。 顺铂作用SKOV3 DDP细胞后细胞凋亡率变化见图2。 表3顺铂作用48 h后细胞周期分布及凋亡情况 Table 3Cell cycle distributions and apoptosis rate for 48 h after being affected by cisplatin DDP （g mL） 0 05 1 2 3 4 5 G0G1 501 18 592 20 630 15 668 22 716 22 761 17 841 29 S 313 36 277 32 220 19 189 24 161 18 137 23 82 21 G2M 185 34 130 37 151 38 142 23 124 32 101 15 98 28 Apoptosis rate 52 29 247 161） 291 231） 342 271） 408 301） 456 121） 495 201） G0G1 464 21 554 17 592 18 647 30 703 21 754 24 799 20 S 341 32 322 30 265 28 206 33 185 36 158 42 91 35 G2M 194 25 125 34 142 31 148 28 113 18 87 26 98 40 Apoptosis rate 41 21 138 231），2） 190 221），2） 233 301），2） 295 191），2） 347 241），2） 400 221），2） SKOV3SKOV3DDP 1）P005 vs control group；2）P005 vs SKOV3 group 秦晓黎，等顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验 85 中山大学学报（医学科学版） 第30卷 3讨论 31顺铂、洛铂、紫杉醇、吉西他滨作用机制 卵巢癌是妇科常见肿瘤，顺铂、紫杉醇、洛铂、 吉西他滨是临床治疗卵巢癌的一线、 二线化疗药 物。 顺铂可与蛋白质、DNA、RNA形成加成物，致 DNA链间或链内交联、DNA蛋白交叉联接，抑制 DNA复制、RNA转录，引起细胞死亡。 顺铂广泛应 用于卵巢癌的治疗，研究发现顺铂能诱导卵巢癌细 胞死亡受体5（death receptor 5，DR5）表达增强，分 别检测化疗前后卵巢癌组织中DR5的表达， 发现 化疗后残余肿瘤的DR5表达增强，阳性率增高10。 洛铂是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌 药，化学名为1，2二氨甲基环丁烷乳酸合铂，是一 种铂（）复合物的非对映异构混合物 11。 洛铂作 用机理与顺铂类似，其抗肿瘤活性主要是形成Pt- GG和Pt-AG的链内交联，从而引起DNA复制障碍。 紫杉醇是一种具有复杂的二帖类化疗结构的 抗癌药。 传统认为紫杉醇的抗肿瘤作用主要是通 过干扰细胞微管系统的生理功能实现的。 紫杉醇 进入细胞后， 与微管蛋白的N端第31位氨基 酸和217-233位氨基酸残基所构成的疏水口袋相 结合，促进微管聚合，抑制微管解聚，从而抑制细 胞有丝分裂和细胞增值12。 另外研究表明，紫杉醇 具有其他多种可能的抗癌机制， 如促进肿瘤细胞 凋亡，抑制肿瘤血管形成，下调端粒酶活性13。 吉西他滨化学名为2脱氧2，2盐酸二氟胞 苷（异构体）。 吉西他滨在细胞内经过核苷激酶 的作用转化为具有活性的吉西他滨二磷酸核苷 （gemcitabine diphosphate，dFdCDP）及吉西他滨三 磷 酸 核 苷 （gemcitabine triphosphate，dFdCTP）， dFdCDP抑制核苷酸还原酶的活性，致使合成DNA 所必需的三磷酸脱氧核苷；dFdCTP与dCTP还竞 争结合至DNA链中，插入至DNA链中脱氧胞苷的 位点，并允许鸟苷与其配对。 吉西他滨分子就被此 鸟苷“掩蔽”使其免受核糖核酸酶的移除修复，造成 DNA链合成停止，进而DNA断裂，细胞死亡14。 32顺铂、洛铂、紫杉醇、吉西他滨的细胞增值抑 制作用 本实验检测这些化疗药物对两种细胞的抑制 率， 结果显示卵巢癌顺铂耐药SKOV3DDP细胞 对紫杉醇、洛铂、吉西他滨无交叉耐药。 因此，对顺 铂耐药的卵巢癌患者，可选用紫杉醇、洛铂、吉西 他滨等无交叉耐药的化疗药物以提高化疗效果。 析因分析显示浓度与时间存在交互作用， 随着浓 度增加，时间延长，化疗药物对细胞的生长抑制作 用越强。 当药物浓度达到一定程度时，继续增加浓 度，抑制率并增加不明显。 这说明化疗药物用药剂 量和效果在一定的药物剂量内有相关性， 高浓度 药物对细胞抑制作用已趋向饱和， 继续增加药物 剂量疗效增加不明显，但会增加药物毒性反应。 近20年来，联合药物化疗已经是卵巢癌药物 治疗的主流。 本实验研究结果显示联合用药组与 相应单一用药组相比，差异有显著性（P005）。金 正均法检测显示洛铂、紫杉醇、吉西他滨两药联合 作用起到了显著的协同作用， 其中吉西他滨洛 铂及紫杉醇洛铂组显著抑制细胞生长。 顺铂耐药 卵巢癌患者可选择吉西他滨联合洛铂或紫杉醇联 合洛铂化疗， 临床上药物联合应用对降低单药剂 量、提高疗效、降低毒副作用、减少耐药性意义重 大。 本实验显示随药物浓度增加， 细胞周期分布 发生变化， 凋亡率增加。 顺铂和洛铂主要作用于 G0 G1期。 紫杉醇表现为G2 M期阻滞，吉西他滨 主要作用于S期。 化疗药物处理的两种细胞均发 生凋亡，与空白对照组相比，差异有统计学意义（P 005）。 相同浓度顺铂作用48 h后，SKOV3细胞 凋亡率高于SKOV3 DDP细胞。 相同浓度洛铂、紫 杉醇、吉西他滨作用后，两种细胞凋亡率差异无统 计学意义（P 005）。 根据化疗药物对肿瘤细胞周 期作用的特点， 可以为临床选择化疗方案提供理 论依据。 本实验结果显示顺铂和洛铂与紫杉醇、吉 西他滨主要作用于不同的细胞周期， 联合应用可 收到分别打击各期细胞的效果。 参考文献： 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