3.4第二章 基本技术带培养基的.ppt

第二章细胞工程实验室及实验基本操作,第一节实验室及仪器设备第二节实验基本操作第三节培养基及其配制,第一节实验室及仪器设备,一、实验室设计二、所需仪器设备,一、实验室设计,细胞工程是基于无菌条件下的研究和操作，需要建立一套满足无菌操作和无菌培养的环境。有机体的组织、器官或细胞可以通过无菌操作过程获得无菌培养物，并在适宜的环境条件下生长、发育和繁殖。,一、实验室设计,基本操作室,无菌操作室,温室,培养室,细胞学实验室,一、实验室设计,此外，显微镜摄影、照片冲洗、显影，均需有一定的条件和设备。但可以根据实验的规模、种类以及工作人员的数目来设计实验室的大小和数目。最主要的目的是便于工作，有利于无菌条件。,组培实验室设计原则,便于隔离便于操作便于灭菌便于观察,1.基本操作室,洗涤室（区）灭菌室（区）储藏室（区）培养基配制室（区）,2.无菌操作室,缓冲准备区(风幕)接种区,3.培养室,主要用于外植体的人工培养、储存及所需仪器设备的放置。为保证培养对象生长、繁殖所需的温度、湿度、光照、培养架、摇床、空调等。根据实验要求，室内不仅有照明设备，还需有暗室设备，以便进行暗培养。,4.细胞学实验室,又称为鉴定分析室，主要用于实验材料的研究和观察分析，应宽敞明亮。所需的仪器设备有各种显微镜及照相系统、解剖镜等。本实验室可根据实际需要而定。,5.温室,植物组织培养的最终产物为试管苗，需对其进行炼苗和移栽，培养正常的生产植株。温室为试管苗提供满足生长的适宜的环境条件。,二、所需仪器设备,必要器皿常用仪器,必要器皿,培养器皿提供接种物生长的器皿。盛装器皿药品溶解或各种培养基母液储备。计量器皿量筒、移液管、微量进样器。金属器械用于解剖、取材、剪切组织,常用仪器设备,1.基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。2.灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。3.无菌操作设备：净化工作台、接种箱。4.光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。5.细胞培养设备：培养设备据需要而定，如培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。6.细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。,第二节实验基本操作,一、清洗二、消毒灭菌三、无菌操作,一、清洗,植物组织与细胞培养工作要顺利进行，首要的关键是必须保证无菌，以避免污染。除培养材料和用具进行严格的消毒外，各种培养用具在消毒以前均需洗涤清洁，以防止带入一些有毒的化学物质，不利于细胞生长。,一、清洗,清洗的对象及方法,清洗的对象,玻璃器皿塑料器皿金属器械除菌过滤器,玻璃器皿,新购置的玻璃器皿，常有游离碱性物质，使用前，先用1稀盐酸浸泡过夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，晾干备用。已用过的玻璃器皿用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。,塑料器皿,新的塑料器皿打开即用用过的塑料器皿先用2%NaOH浸泡过夜，然后用清水冲洗，再用2%5%稀盐酸浸泡30min，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。,金属器皿,新的金属器皿用热洗衣粉水洗净，冲洗后擦干即可。另，培养器皿已污染时，用蒸汽高压灭菌后清洗。,二、消毒灭菌,1.消毒灭菌的方法2.消毒灭菌的对象,二、消毒灭菌,培养植物组织和细胞的培养基，含有植物细胞所需的营养物质，同时对于细菌等微生物也是很好的营养物质。微生物比植物细胞生长更为迅速，并且产生毒素，以致培养的细胞死亡，因此防止污染是植物组织培养技术中的重要环节。,发生污染的来源有：,（1）器皿与用具（2）培养基（3）培养的材料（4）操作时的空气（5）工作人员操作带菌,消毒方法一般有物理方法和化学方法两种，即用物理和化学方法杀灭微生物。,物理方法,干热灭菌法湿热灭菌法过滤除菌法射线消毒灭菌法酒精灯消毒灭菌法,化学法：,消毒剂灭菌法（乙醇、过氧乙酸、甲醛、升汞等）抗生素抑菌法（青霉素、链霉素、新霉素、潮霉素等）,1、培养基用湿热灭菌,培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,1、培养基用湿热灭菌,注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。,高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。容器的体积/mL在121灭菌所需最少时间/min20-501575-15020250-50025100030,灭菌结束,到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。,灭菌结束,当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。,注意事项,对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭局20-30分钟。,2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌,在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。,3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌,干热灭菌是利用烘箱加热到160-180的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170持续90分钟来灭菌。,干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。,4、不耐热的物质采用过滤灭菌,经高温灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。NAA，2，4-D和激动素等在高温下是比较稳定的。,4、不耐热的物质采用过滤除菌,以上所述物质的化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能。又如赤霉素、玉米素、脱落酸是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。,防细菌滤膜的网孔的直径为0.220.45微米，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，从而达到除菌的目的。,过滤除菌操作步骤：,首先将过滤器、接液瓶用纸包好，滤膜可放在培养皿内用纸包好。使用前先经121高压蒸汽灭菌30分钟；在超净工作台上，将滤器装置装好，用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面向上；然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。,在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。,5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌,（1）紫外线灭菌（2）熏蒸灭菌,在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质很核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200-300nm，其中260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2米为宜。,（1）紫外线灭菌,（2）熏蒸灭菌,用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。,熏蒸灭菌原理,化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。,常用熏蒸灭菌方法,常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。,6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌,物体表面可用一些药剂涂搽，喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用75%的酒精反复涂搽灭菌，1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭也可以。,7、植物材料表面用消毒剂灭菌,从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作转移到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体（explant)。,首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。,洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。,第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。,有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。,第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1-2种使用见下表。常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,几种常用消毒剂的效果比较,消毒剂灭菌原理,次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8-10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。,消毒剂灭菌方法,灭菌时，将沥干自来水的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。（超净台）,消毒剂灭菌方法,在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。,表面活性剂,在灭菌溶液中加吐温-80或TritonX效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。,无菌水漂洗,最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要求3分钟左右，视采用的消毒液种类，漂洗3-10次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。,三、无菌操作,1.无菌操作前的准备工作2.无菌操作步骤3.污染源及其表现特征,1.无菌操作前的准备工作,1.在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；2.在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；3.接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；4.上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；,2.无菌操作步骤,1.先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；2.接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；3.接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。,3.污染源及其表现特征,当培养材料、转接器皿、无菌操作环境等灭菌不彻底时，培养材料则携带有微生物，当其被转接到营养丰富的培养基上时，微生物繁殖迅速，出现各种污染菌斑。微生物生长时分泌出对植物组织有毒的代谢废物，致使培养材料死亡或失去使用价值。,3.污染源及其表现特征,在培养过程中，若培养材料附近出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫，则是细菌性污染；而培养基表面出现的黄色、白色、黑色等不同颜色的霉菌，则属真菌性污染。,是植物离体培养中的营养和能量来源，也是人们调节和控制培养物生长发育的重要因子。是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。,第三节培养基及其配制,这些必需元素在生物体内的生理作用重要有四方面：组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质；构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢；元素间的相互协调，维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；调节形态发生和组织器官的建成。,在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。,因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,第三节培养基及其配制,一、培养基成分二、培养基种类三、培养基的配制方法,一、培养基成分,1.无机元素（大量元素、微量元素）2.有机元素（氨基酸、维生素、糖类）3.植物生长调节物质4.琼脂5.水,1.无机元素,无机营养对植物的生长发育十分重要。一旦无机元素供应不足，组织培养材料就会出现一定的缺素症状，如植株失绿、细胞分裂停止、细胞分化受阻等；但营养过多，也会造成植物细胞代谢障碍，生长抑制等毒害现象。,大量元素,培养基中无机元素用量差异较大，可分为大量元素类和微量元素类。指使用浓度大于0.5mmolL的元素，有碳、氢、氧、氮、钾、磷、镁、硫、钙等。,无机元素的作用,N：是各种氨基酸、维生素、蛋白质、和核酸的重要组成成分，在制备培养基时以NO3和NH4两种形式供应。P：是磷脂的主要成分。常用的物质有KH2P04或NaH2P04。K：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。,Mg、S和Ca：Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H20提供。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,2.微量元素：指使用浓度小于0.5mmolL的元素主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用硫酸铁，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA结合成螯合物使用。,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,2.有机元素（氨基酸、维生素、糖类,氨基酸类维生素类糖类天然有机添加物,是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。,氨基酸类,维生素类,这类化合物主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mgL。,糖类,是培养基的主要碳源，为细胞提供合成新化合物所需的碳骨架，并为细胞呼吸代谢提供底物与能源，维持一定的渗透压。,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。,肌醇又叫环己六醇,在糖类的相互转化中起重要作用，是培养基中不可缺少的有机营养。它可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质；还可以与6分子磷酸残基结合形成植酸。植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁；植酸也可以形成磷脂，参与到细胞膜的组分中。,使用浓度一般为l00mgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,天然有机添加物,是化学成分不明的复杂的营养混合物。尽管它们对细胞和组织的生长和分化有明显的促进作用，但因成分不定，质和量受多种因素的影响，实验的可重复性差，应尽量避免使用。常用的有机附加物有:椰乳：香蕉：水解酪蛋白：,3.植物生长调节物,植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,3.植物生长调节物,生长素类细胞分裂素类赤霉素类脱落酸乙烯,在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感，在极低的浓度下，就可促进根生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。一般生长素浓度的使用为0.055mgL。,生长素类,IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,细胞分裂素类,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、Zt(zeatin玉米素)等，细胞分裂素0.0510mgL。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。,生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,激素调控模式,生长素/细胞分裂素比例,高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；适中：有利于根芽的分化低：有利于芽的形成,有20多种，培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。但赤霉素不耐热，水溶后不稳定，故应采用过滤除菌，并用酒精溶解。,赤霉素类,脱落酸,脱落酸抑制蛋白质合成，抵消和抑制生长素、细胞分裂素和GA发挥作用。ABA诱导休眠，促进衰老和脱落。ABA不能高温高压灭菌，故应采用过滤除菌。,乙烯,乙烯具有促进果实成熟，促进脱落和衰老等作用，在组织培养中很少使用。,4.琼脂,培养基有固体和液体两种。固体培养基最好的固化剂是琼脂，它是从海藻中提取的一种高分子多糖类物质，不提供任何营养成分。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。,4.琼脂,琼脂的用量在610g/l之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好，新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,琼脂,加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。,其它,有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,5.水,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基时尽量用蒸馏水或去离子水，以防成分变化。但大规模生产时可用自来水。,培养基的构成除了上述5种成分以外，有时还加入一些其他物质，如吸附用的活性炭、防止酚类污染的物质、抗生素等。另外培养的植物材料大多要求弱酸性环境，所以培养基在灭菌前需将PH调至5.65.8。当PH高于6时，培养基变硬，不利于培养物的生长；而PH低于5时，琼脂不能很好地凝固。,抗生物质抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。,活性炭,活性炭结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质。,活性炭的应用：茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，一般为0.1%0.2%，不能超过0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用，可能是通过减弱光照保护IAA。降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，一般浓度为0.3%。,研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性炭放人培养基，会带来不良的后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,活性炭的副作用,二、培养基种类,根据培养基中无机盐的含量可分为4类，分别如下：高无机盐含量培养基较高硝酸钾含量培养基中等无机盐含量培养基低无机盐含量培养基,培养基种类,根据功能可分为以下几种：诱导培养基分化培养基增殖培养基生根培养基,培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如hite培养基，urashige和koog培养基（简称培养基），也有对某些成分进行改良称作改良培养基。,而我们在做培养基时常说的基本培养基均是培养基的名称，如MS、B5、N6等。,MS基本培养基配方,在培养基配制时，为了使用方便和用量准确，并减少工作量，常将培养基成分首先配制成比需要浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度按比例稀释。因此培养基的配制包括母液的配制和培养基的配制。,三、培养基的配制,1.培养基母液的配制2.培养基的配制,1.培养基母液的配制,母液配制的目的方便配置其他培养基；保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,培养基母液的配制,母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如a2和42，a2、g2和43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。,母液配制的药品与器材,药品：配制MS培养基所需的药品、生长调节物质、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL,器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱等。,母液配制（以MS培养基为例）,有机物母液,铁盐母液,无机大量母液,无机微量母液,无机大量母液(扩大10倍配1L),成分,硝酸钾硝酸铵硫酸镁磷酸二氢钾氯化钙,称量工具,注意：无机大量母液中的各种物质在混合过程中有些离子易产生沉淀，应使每种物质先充分溶解，再进行混合，而且钙盐最后缓慢加入进去。,(mg/L),MS培养基配方,插入,硼酸，硫酸铜，硫酸锰，硫酸锌，氯化钴，钼酸钠，碘化钾,用分析天平按表准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000ml。,无机微量母液（扩大100倍配1000ml）,