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文档简介

04 宁省地方标准 23962015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 015 18发布 2015 18实施 辽宁省质量技术监督局 发布 23962015 I 前 言 本标准按照 本标准由辽宁省农业科学院提出。 本标准由辽宁省农村经济委员会归口。 本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。 本标准主要起草人:陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、李丹、王平、李金红等。 本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。 23962015 1 水稻品种抗稻瘟病基因检测 范围 本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的 测法,包括原理、仪器设备、试剂和材料、防污染措施、实验步骤及结果分析。 本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 6682分析实验室用水规格和试验方法 转基因产品检测 实验室技术要求 农业部1485号公告010 转基因植物及其产品成分检测 术语及缩略语 下列术语及缩略语适用于本标准 向引物:处于称向引物:处于称参引物:在聚合作用起始时,可以刺激合成另一种大分子,并与反应物以共价键形式连接的序列。 脱氧核糖核酸。 S 高保真): 53.7 0 单核苷酸混合液(10 醋酸、 23962015 2 酸染料,替代溴化乙锭。 标准分子量的核酸标记。 碱基对。 羟甲基氨基甲烷。 4 原理 根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物,提取不同水稻品种的试样进行据是否扩增获得预期大小的5 仪器设备 式离心机。 胶成像系统。 脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。 温水浴锅。 析天平:盖塑料离心管:2钵、研杵。 液枪和吸头:1000 L,200 L,10 L。 它相关仪器设备 6 试剂和材料 试水稻叶片或种子。 S )。 6.5 0 以清楚地区分1000000用时稀释50倍。 23962015 3 样缓冲液。 物 见附录A。 除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 6682规定的一级水。 7 防污染措施 检测过程中防止污染的措施按照8 实验步骤 稻农业部1485号公告010 的规定执行。 将试样)、向引物及反向引物及 先后顺序加入: ) 6 L 2.5 L 正向引物及反向引物(100 L (终浓度: , 试样 1 L (20100 L S L) L 用移液枪抽打混匀,盖上盖子短暂离心,置于冰上待用。 离心管置于应程序为: 95 预变性5 5 变性30 s,55 61 退火30 s, 72延伸30 s 60 s(每对引物的退火温度及延伸时间参见附录A),29个循环,72 总延伸5 保存。 用200 g,加入1口用锡箔纸盖好,置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 脂糖冷却至50 L 匀,迅速将胶倒至模具中,放置上样梳。 胶完全凝固后,拔下上样梳,置于盛有1取5 L 1样,130 h1.0 h。 泳结束后,取下琼脂糖胶,利用凝胶成像系统观察电泳条带大小,并照相。 23962015 4 将25序。 9 结果分析 定原则 板质量的检测 所有参试品种的用水稻内参引物(测,以确定用水稻内参引物(增时无特异性需重新提取试样果判定原则 鉴定水稻品种中是否携带抗稻瘟病基因时,如不能扩增出特定长度的 物,则可判断试样中不含有相应的抗病基因;如可扩增出特定长度的需结合电泳结果和测序结果共同分析。 电泳结果分析 用附录该品种携带其 泳图中其产物片段应处于00之,如无序结果分析 物的序列与附录析在 431 33 碱基序列为 该品种所含抗病基因则为之,如该品种在431 33 认为参试品种含有 电泳结果分析 用附录该品种携带其泳图中其产物片段应处于之,如无序结果分析 65 碱基序列为抗病等位基因;反之,如为 其它序列,则认为参试品种含有感病等位基因。 电泳结果分析 用附录该品种携带其泳图中其产物片段应处于0000之,如无 23962015 5 序结果分析 34 碱基序列为抗病等位基因;反之,如为 其它序列,则认为参试品种含有感病等位基因。 电泳结果分析 用该品种携带其泳图中其产物片段应处于000之,如无序结果分析 在685 87 56 该品种所含抗病基因为则为在 685 87 56 该品种所含抗病基因为在685 56 该品种所含抗病基因为在 685 87 56 该品种所含抗病基因为 抗病等位基因;反之,待检品种在上述区域序列与几种等位基因均不符,则认为参试品种不含有 电泳结果分析 用该品种携带其 之,如无序结果分析 物的序列与附录 B 所示序列 对,如在 138 后及在 321 后分别有及 8 个碱基的缺失(即去除前后引物结合的位置,参试品种序列应与则该品种所含抗病基因为之,若待检品种不存在上述特定序列的缺失,则认为参试品种不含有 病基因。 电泳结果分析 用该品种携带其泳图中其产物片段应处于00 500 之,如无序结果分析 73 碱基序列为抗病等位基因;反之,如为 其它序列,则认为参试品种含有 23962015 6 感病等位基因。 电泳结果分析 用该品种携带其泳图中其产物片段应处于00之,如无序结果分析 在295 97 在 319 21该品种所含抗病基因则为在 295 97 及在319 21 认为参试品种含有该品种携带其 之,如无 23962015 7 A A 附 录 A (规范性附录) 用于扩增抗稻瘟病基因的引物 抗病基因 引物序列 (5 退火温度 () 延伸时间 (s) F 5 30 F C 55 30 F 5 30 F 5 60 F 55 60 F C C 55 30 F 5 40 F 6 70 F

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