DB21∕T 2533-2015 赤羽病病毒荧光PCR检测方法

41  宁 省 地 方 标 准  25332015 赤羽病病毒荧光of 015  15发布 2015 - 12 - 15实施 辽宁省质量技术监督局   发 布   25332015 I 前   言 本标准按照 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。   本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：万超、吴斌、屈菲。  25332015 1 赤羽病病毒实时荧光 范围 本标准规定了赤羽病病毒（时荧光本标准适用于赤羽病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。  6682  分析实验室用水规格和试验方法  1193  基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 到阈值的循环数（碳酸乙二酯（NA 糖核酸（实时荧光光逆转录聚合酶链反应（4 原理 采用对赤羽病病毒基因组计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记3'端标记它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的发出的荧光不再为着5 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 6682规定的一级水；所有试剂均用无剂  25332015 2 （见附录   解液。 氯甲烷。 5%乙醇（见附录  丙醇（冷）。 他试剂：荧光  50 附录  10 见附录 2.5  可采用等效商品化试剂。   10 (5 U/L)。 物：合成一对特异性引物：上游引物5'- 下游引物5'- '配制成 5 ，保存。 器与耗材 荧光 测仪。 高速台式冷冻离心机（最高可达13 000 r/ 微量移液器：L10 L，5 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。 混匀器。 冰箱(2。 研钵。 微量可调移液器。 离心管。 吸水纸。 心管 量带芯吸嘴（10L，100L，1000L）。 6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守  1193 的有关规定。 7 操作步骤 本的采集与处理 样前处理：取 2000g 离心10沉淀，收集上清。继续进行核酸提取。 织样品前处理：取100织样品，剪碎，按1：5 的比例加   次，离心，取上清液，存，备用或直接继续进行核酸提取。 酸提取 所有菌后方可使用。自上述完成前处理的样品中加入1温放置5烈振荡15秒，室温放置310000水相转移到新管中，加入50020预冷)，室温放置1010000取离心后的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500l（注意不要吸出中间白色絮状层），轻轻颠倒 25332015 3 均匀。于4条件下，12000r/出轻倒去上清液，加入15%乙醇，颠倒洗涤。于4条件下，12000r/出轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。每管加入20轻混均，溶解管壁上的000r/上保存备用。提取的增或放置于箱备用。 时荧光 反转录 于7.2 0反转录酶缓冲液（200 和 500 2l；下游引物4l；10 mM 2l；5 l；00 l)，水至20l。瞬时离心，95  55 40即进行存备用。 光 应体系: 10冲液，  L；10  10 上下游引物1L，5探针 1L， (2U/L),L 用补足25配制的荧光混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后再每个 5L。 应参数 录样本摆放顺序。循环参数设置如下： 第一阶段，变性  95  5 转录  45 40 第二阶段，预变性  95  5 第三阶段，95 30 s、60 1 0 个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。 8 结果判定 果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 控标准 性对照无 性对照的 8，并出现特定的扩增曲线。 阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。 果描述及判定 性判定 无明样品中无赤羽病病毒核酸。 性判定 0，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在赤羽病病毒核酸。  25332015 4 A  A  附 录 A (规范性附录) 试剂的配制 入7静置过夜，采用(121士2)/5  配制液。  称取一水合磷酸二氢钠(20)二水合磷酸二氢钠(于蒸馏水中，定容至1L。  称取十二水合磷酸氢二钠(2 二水合磷酸氢二钠(于蒸馏水中，定容至1L。 称取17适量蒸馏水溶解，量取13液和87液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)/5 5乙醇溶液 量取