【基金标书】2010CB911900-免疫相关重要蛋白质的生物学研究

项目名称： 免疫相关重要蛋白质的生物学研究 首席科学家： 张学敏 中国人民解放军军事医学科学院 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 总后勤部卫生部 一、研究内容 针对免疫识别、免疫应答与免疫耐受的主要科学问题，研究从免疫细胞对抗原的识别至产生效应的整个过程所涉及免疫细胞（ T、 B、 系列蛋白质分子及其在免疫过程中的功能，从分子水平阐明机体产生各种正、负免疫应答的细节和关键点，不同应答效应及其调控的机制，进而掌握免疫过程及其调节的特点和规律。 1. 与免疫识别相关的蛋白质结构与功能研究。研究 现天然免疫 “ 泛特异性识别 ” 的生物学特点和结构信息证据，发现新的天然免疫识别受体（或新功能）；研究以 析 讨自主发现的天然识别受体 2. 与免疫应答相关 的蛋白质结构与功能研究。揭示在肿瘤发生早期天然免疫效应细胞的活化及对肿瘤特应性免疫应答的激活作用及其作用的分子机理。探讨 配体介导的肿瘤微环境是否集聚处女 定 究 胞与 析 作用于激活期还是效应期，阐明 析穿孔素及 “ 孤儿 ” 颗粒酶的晶体结构，阐明穿孔素和 “ 孤儿 ”颗粒酶在 析自主发现 过 讨 细胞、 NK 3. 与免疫调节和免疫耐受相关的蛋白质结构与功能研究。探讨 15个自主发现的新分子以及 5个关注的分子在免疫调节和免疫耐受中的作用和分子机制，研究不同的分子在不同细胞内的表达调控模式，重点关注这些分子在 顾重要的分子在 细胞抗原受体 (的作用机制，同时研究这些分子在免疫调节中相互作用分子，并且建立动物模型，探讨这 些分子在感染、抗原特异性免疫应答以及免疫耐受中的作用。 4. 参与免疫信号通路调控的蛋白质结构与功能研究。应用最新质谱技术等手段研究 导的 路激活过程中重要蛋白质复合体的形成及活化机制，并探讨复合体关键组分对该通路的调控机制；深入研究 号通路的机制；深入研究 讨 模型研究导致 二、预期目标 总体目标： 从我国蛋白质科学研究的重大需求以及挖掘重要免疫相关分子的结构、功能和作用机理等重大科学问题出发，建立基于蛋白质科学的免疫学研究新模式，即应用蛋白质及其复合体结构与功能研究的方法，深入发掘并解析免疫过程中新的蛋白质分子、相互作用网络、泛素化等翻译后修饰、结构特点及其定位规律，在免疫识别、免疫应答与耐受和免疫调节的分子机理研究上取得重要突破，为攻克感染、肿瘤或自身免疫疾病提供坚实的理论基 础，为相应的干预治疗提供新的策略和新的靶点。 五年预期目标 : 1、 通过质谱技术成功鉴定免疫识别、应答活化及调节过程中重要信号通路中的蛋白质复合体，发现 10外，揭示已有工作基础的 15个免疫相关新蛋白质分子在免疫识别、免疫调节和免疫耐受中的作用和分子机制，为免疫相关疾病的药物研发提供 2 2、 较完整阐明 2现并解析 1个新的天然免疫受体调控蛋白的功能结构特征；解析 1个天然免疫识别受体的新结构或天然免疫 识别受体相关的复杂蛋白质结构；阐明 1个基于天然免疫识别受体的免疫突触的形成结构和蛋白质组成。 3、 揭示在肿瘤发生早期天然免疫对获得性免疫的激活作用机制，探明细胞毒性 示抗肿瘤免疫效应的功能与结构的关系，加深对免疫系统排斥肿瘤机理的认识。 4、 发表高水平研究论文 30篇以上，其中 0论文 3篇， 0论文 5篇。获得一批高水平的拥有自主知识产权的技术成果，申请专利 10项以上。 5、 培养一批在免疫学和蛋白质科学领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才；造 就一支跨学科、跨领域、精诚合作、团结奋进的科研队伍。 三、研究方案 学术思 路 对 免疫识别 、 免疫应答 /耐受 、 免疫调节过程 中的 的极其复杂的免疫蛋白质系统，目前缺乏整体了解，特别是对 一些重要 蛋白质在空间和时间上的表达 、 修饰 、 定位，以及相互作用和在执行功能上的相互关系了解甚少。 本项目 以免疫识别 耐受 以 有较好研究基础的免疫细胞为主要模型 ， 通过蛋白质技术 发现新 的 免疫 相关蛋白质及其复合体， 解析结构信息，探讨其在 免疫识别 、 免疫应答 /耐受 、 免疫调节过程 中的功能 ；分析 磷酸化、泛素化等翻译后修饰 对其功能的影响， 并 揭示免疫 信号通路 的 调控 机制。 本项目还将深入研究已 自主发现的 系列 新分子以及 其它重要蛋白质 在免疫 过程 中的 功能 和机制 。 以上努力，使我们可能解决免疫学中一系列亟待突破的重要科学问题： 1） 天然免疫识别 “泛特异性 ”的生物学特点及 识别受体的 结构 与功能； 2） 天然免疫对获得性免疫细胞活化的分子机理和抗肿瘤 分子机制 ; 3） 免疫调节和免疫耐受的分子机制，特别是免疫应答过程中的负向调节机制 ; 4）参与 免疫调节 重要信号通路的关键蛋白质发现与功能揭示。 这些重 要 免疫学科学问题的 研究一旦有所突破，将对人类疾病的防治带来巨大益处。 技术途径 1. 表达模式研究 ：所需使用的免疫细胞一方面使用既有细胞系，另一方面通过原代分离和体外培养产生。 2. 免疫细胞功能调节研究 3. 信号传导通路研究 4. 相互作用分子研究 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 选择一批受体结构域基因片段进行克隆表达 ；进行 天然免疫识别相关蛋白的基因表达、蛋白纯化和批量制备 。 2. 构建不具活性的穿孔素前体 ； 分离鉴定与 颗粒酶 K 相作用的底物 ；表达颗粒酶 H 和 M； 表达重组行结晶条件摸索和高质量结晶实验，衍射分析 3. 初步完成所关注免疫分子在免疫识别以及免疫调节中的表达调控模式，完成一些重要表达载体的构建和鉴定以及一些细胞系的建立鉴定 。 4. 建立激活信号转导通路细胞模型 ；观察 活信号 通路 的动态变化过程情况 ； 研究 相互作用及其动态变化 ；分析 酸化水平调控以及激酶活性。 5. 探讨 径发挥抑制作用所依赖的关键 结构域和关键氨基酸 ； 探讨 互作用 的结构基础和调控机制 ； 检测 1. 建立天然免疫受体表达的研究平台和相关技术； 1 2. 表达具生物活性的穿孔素及其功能片段 ； 分离鉴定颗粒酶 K 的作用底物 ； 确定 的结构模型。 3. 完成 10建原核和真核等表达载体30立稳定干扰或过表达细胞系 20 4. 建立 活信号转导通路细胞模型 ； 明确 5. 明确 挥作用的结构基础 ；明确 互作用 的结构基础和调控机制 ； 明确 6. 发表 第 二 年 1. 天然免疫识别相关蛋白的克隆、表达、纯化、单抗制备； 初步 研究 以开展天然免疫识别相关蛋白受体 /配体的相互作用研究。 2. 解析穿孔素及其功能片段的结构 ；1. 获得 1步获得以 得 1个天然免疫受体蛋白微晶 。 2. 获得穿孔素活性片段的晶体结 构；年度 研究内容 预期目标 研究颗粒酶 对细胞的杀伤效应及杀伤机制 ； 探索颗粒酶 的结晶条件，进行晶体结构分析。 3. 检测 细胞和 P 实验，差异蛋白进行质谱鉴定。 4. 完成所关注免疫分子对免疫细胞生物学功能的影响，初步完成相关的信号传导通路的研究 。 5. 检 测 病毒及 :C)激活的 录活性 、 响并进一步验证 ； IB磷酸化水平以及蛋白质稳定性的调控分析。 6. 检测 制 径关键结构基础的结合蛋白 ； 探讨 制 径所依赖的关键结构域和关键氨基酸 ； 探讨互作用在肿瘤和自身免疫病中的可能应用。 确定 颗粒酶 在 确定 和 胞的功能影响 ； 明确和 3. 完成 8免疫分子对树突状细胞、单核巨噬细胞以及其他免疫细胞的细胞因子分泌等基本免疫学功能的影响研究；完成 8免疫分子在免疫细胞内在受到 处理后信号传导通路 变化的检测 。 4. 质谱鉴定刺激不同时间形成的 初步 明确 5. 揭示 径抑制作用的机理 ； 明确 6. 发表 第 三 年 1. 摸索天然免疫识别相关蛋 白晶体生长条件；制备单抗和小分子靶点探针；验证以 核心 突触蛋白的核心成分并对其进行成像分析； 2. 天然免疫识别相关蛋白的突触形成和 测定穿孔素对细胞的损伤作用 ； 分析线粒体膜通透性 、 活性氧自由基 、促凋亡因子 等 的 变化； 激活 用 过继转移到荷瘤鼠，分析这些细胞的增殖作用 ； 验证 1. 力争获得 1 个能够适合于 X 射线晶体衍射的晶体 ； 获得 2点探针；明确核心的突触蛋白的成分及其分布； 2. 研究穿孔素对浆膜及对线粒体的损伤作用 ； 确定 系； 明确和 3. 明确 8免疫分子的基本信号传导通路，初步确立 6 4. 初步揭示 控 年度 研究内容 预期目标 3. 检测 和 通过 感染清除中的作用。 4. 验证复合体成分 ； 检测 酸化、二聚化以及入核能力的影响 ； 检测 否参与调控 分析已知 控子在 酶活性中的作用模式。 5. 探讨 达紊乱 与肿瘤和自身免疫病 发病机制 的关系； 探讨 探讨 5. 了解 达紊乱与肿瘤和自身免疫病发病机制的关系 ； 明确 明确 的 结构突变。 6. 发表 申请专利 1项。 第 四 年 1. 研究 2. 观察穿孔素或 /和颗粒素 作用下，颗粒酶进入靶细胞的部位 ； 分析2胞的增殖和细胞因子的产生 ； 研究 利用 3. 建立相关重点关注基因的转基因小鼠模型，初步探讨所关注免疫分子在疾病模型中的作用以及其体内介导免疫识别、免疫调节、免疫耐受的作用，验证这些分子与相互作用分子的相互调节 。 4. 检测 况； 研究 培养上清中病毒滴度变化的 影响； 分离原代巨噬细胞，检测 培养上清中泌量的变化 ； 分1. 完成 1 个免疫受体蛋白的晶体结构测定，收集复合物晶体的衍射数据；初步明确 初步明确天然免疫识别相关蛋白在肿瘤免疫逃逸中作用； 2. 探明穿孔素如何介导颗粒酶进入肿瘤靶细胞 ； 明确 3. 建立 8基因小鼠动物模型，了解 4一步确认免疫分子的相互作用蛋白质和作用的效应和机制 。 4. 初步 阐明新的 合体成分的功能及其调控机制 ；初步 阐明控 年度 研究内容 预期目标 析 肿瘤坏死因子诱导肿瘤细胞凋亡的调控 作用 。 5. 探讨 途径和 径 的高水平活化。 5. 了解 达紊乱与肿瘤和自身免疫病发病机制的关系 ； 明确 达异常 与 促进途径和 水平活化的 关系 。 6. 发表 文 5 ， 申请专利2第 五 年 1. 多个免疫受体蛋白及其复合物的晶体生长及解析；利用单抗、小分子靶点探针等研究受体 /配体的相互作用。 2. 研究 胞与 导的肿瘤细胞排斥 的关系； 分析