【基金标书】2010CB912600-内源性代谢产物硫化氢与介导心脏生理与病理机制的蛋白质靶分子的相互作用及其机制

项目名称： 内源性代谢产物硫化氢与介导心脏生理与病理机制的蛋白质靶分子的相互作用及其机制 首席科学家： 朱依谆 复旦大学 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 教育部 上海市科委 一、研究内容 综合应用代谢组学、基因组学、蛋白质组学、结构生物学等方法和技术， 以 重要的心血管生理和病理调控通路 为 研究主要对象 ， 研究 硫化氢 与蛋白质 靶分子的 相互作用 及其 机制 ；研究 硫化氢 对 蛋白之间 、 蛋白 质 和 核酸之间 相互作用 的调节及其 机 制 。 阐明 心脏中内源性硫化氢 在生理和病理情况下的生成代谢途径，探讨 硫化氢 的分解代谢过程。 1. 揭示若干 控跨膜离子转运的重要通路；发现若干 接作用的靶分子；明确靶分子蛋白相互作用的分子机制。 2. 分离和验证 胞效应相关的细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路中的重要蛋白因子，结合基因组学，蛋白质组学 , 生物化学和分子生物学以及细胞生物学的实验结果揭示 胞效应的分子机制和重要蛋白的作用机理和生物学功能。 3. 应用独创的半胱氨酸衍生物 作为分子探针，全面揭示含硫氨基酸体内代谢的基本规律。筛选出与含硫氨基酸及探针药物 心肌缺血保 护作用密切相关 蛋白分子，并对其功能进行研究，探寻含硫氨基酸及 探针药物生物学效应和代谢通路的机体内源性拮抗剂和抑制剂，可能是具有临床应用前景的防治心血管疾病的新策略。 4. 阐明心脏中 径和 径的表达调控机制及两条途径的协调机制。阐明生理条件和病理条件下表达调控的实时监测和在体研究，同时对阐明 调控网络也非常重要。阐明 膜传递及与氧化性小分子和金属离子的反应特性。 跨膜传递关系到内源性 作用方式以及外源性 体作为药物的可行 性；与氧化性小分子和与金属离子的反应特性则 与 分解代谢相关。 二、预期目标 （一）总体目标 采用蛋白组学 和代谢组学 的经典研究方法，结合心血管疾病的生理和病理过程，从细胞水平到整体水平进行动态研究。 以 缺血性心脏病 为核心， 探讨 体内活性代谢产物 小分子气体信号 心血管系统保护作用 的分子机制， 筛选分离出 特异的靶蛋白 、 目标 基因和生物标记物 ； 进一步利用结构生物学，生物化学的方法研究蛋白之间，蛋白和 相互作用机理 。 全面 阐述 心脏中内源性 生理和病理情况下的生成代谢途径，以及生成的内源性 细胞内和细胞间的传递过程以及传递过程中 与氧化性小分子（如 金属离子的相互作用，从而探讨 分解代谢过程。 （ 二 ） 五年预期 目标 1. 阐明 细胞水平上的传递过程，探讨 递机制及传递过程中参与的反应，如 氧化应激蛋白和凋亡相关蛋白的构象和正常功能的影响 。该工作可能找到体内 的作用靶分子，从而为最终阐明 心脏保护作用的机制 提供理论依据 ； 2. 阐明 递机制及传递过程中 蛋白之间，蛋白和 相互作用机理 ，为在哺乳动物中揭示 2论依据 ； 3. 细胞水 平和整体水平上研究内源性 生相关酶 应激条件下（如氧化压力）和病理状态下表达调控的机理，找到相关转录因子及激活这些转录因子的信号通路和相关蛋白分子，为设计激活体内内源性 生的药物打下基础； 4. 培养一批国际一流心脏蛋白组学领域科研人员，培养一批高水平的中青年科学家，提高我国蛋白组学科研水平和自主创新能力，增强国际竞争力。 5. 研究成果将以论文形式表现，发表高水平论文 2030篇（ 其中 510篇 0），申请 1015项发明专利。 三、研究方案 （一）课题总体思路 鉴于目前蛋白质组研究比较多 地侧重于蛋白质表达谱的研究上，对于在重要生理、病理过程中调控通路的蛋白质间的相互作用的研究有待深入研究。此外，蛋白质是在有机体内发挥生理功能的；而机体内存在着众多可与蛋白质结合的小分子物质，其中包括代谢产物。内源性代谢产物可能和蛋白质结合，从而改变蛋白质分子的空间构象和功能。因此，研究内源性代谢产物对蛋白质组的作用是进一步了解蛋白质在活体的功能是至关重要的，尤其是如能发现可直接与代谢产物发生相互作用的蛋白质，不但对于了解重要的生理、病理调节机制具有重要的科学意义，而且也将有助于蛋白质学的研究更加深入，更有望 了解各重要生理、病理过程的机制；有望形成蛋白质组学研究的一个分支，即小分子活性物质对蛋白质大分子结构和功能的调控。 体来讲国内外对该领域的研究尚处于起步阶段。通过本课题的研究，有望分析 蛋白质之间的相互作用，发现相互作用的基本规律，揭示 控若干重要心血管生理、病理过程的机制。其研究成果还有望对于蛋白质组学的进一步发展作出一定的贡献。 （二）课题的特色和创新点 心脏离子通道功能调节和血管新生是调节心脏生理功能和心脏缺血等疾病的重要调控通路 ，本课题组于 2007 年和 2008 年分别发现了 上述两条心血管通路的调节作用。本课题组发现在心肌细胞中， 制心肌细胞膜 L 型 道的开放；在内皮细胞中，移、管腔形成以及在整体模型中的血管新生。但是 其是 项目在前期工作的基础上，推定 子通道，或与其相偶连的信号分子；在内皮细胞直接作用于 1 生存素信号通路中 的信号分子，在此有限范围中寻找 接作用的靶分子。 如能取得成功，对于揭示蛋白）的空间构象和功能的具有重要的科学意义，可能会发现一种蛋白功能调控的新规律。 首次应用代谢组学方法系统研究含硫氨基酸及其衍生物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、在体内的代谢途径，包括 有关中间代谢产物 。此外，针对缺血、缺氧性心脏疾病，特别是含硫氨基酸及 探针药物 行生物化学，结构研究和代谢功能的研究，及上述代谢途径的变化 。在此基础上，筛选和优化具有治疗前景的可以生 成内源性 化合物，并进行合理的结构改造。项目涉及的领域和技术非常多，预期在缺血、缺氧性心脏疾病的基础研究、临床治疗和医药开发方面取得突破性进展。 首次通过裂殖酵母模式生物的基因组学和蛋白组学重点研究 细胞周期， 细胞增殖和凋亡过程中 信号通路的影响，结合用酿酒酵母的突变体库的筛选 分离出 胞效应信号传导通路中的多个重要蛋白因子，找到这些重要蛋白因子在大鼠心肌细胞中的同源蛋白，进一步利用结构生物学，生物化学的方法研究蛋白之间，蛋白和 合基因组学和蛋白质组学 , 生物化学 和分子生物学以及细胞生物学的结果，揭示 阐明 通过转基因小鼠技术构建携带 基因小鼠，从而在整体水平上实现对心脏中内源性 明生理和病理条件下心脏内源性 控机制及调控网络，为通过药物干预心脏内源性 明体内 而探讨 利用转基因小鼠技术，实现 对 时研究心脏内源性 阐明各自的调控网络又研究两条途径之间的关联。既研究生理条件下内源性 强调缺血、缺氧等病理条件下调控机制的变化。研究 讨内源性 （三）课题设置 课题 1. 内源性代谢产物 心脏细胞 离子通道和血管新生 通路的调 控 机制 主要 研究内容 ： 离子通道和血管新生 是与心脏 生理、病理 疾病密切相关的两条重要 调节通路 。 本课题组首先发现 影响 上述两条重要调 控 通 路 ，并在 前期研究 中率先 发现 抑制心肌细胞膜 上 L 型 道的开放； 可 促进 内皮 细胞增殖、迁移、 形成新的 血管 。在 此 基础 上 ，我们拟深入 研究 控 L 型 道 与促血管新生 的分子机制 ，确定 用的关键靶蛋白，阐明其调控网络，为通过 径干预心脏病打下基础 。 研究目标： 1. 揭示若干 控跨膜离子转运的重要通路，找到若干 接作用的靶分子，深入研究 其的调控机制。 2. 找到 控血管新生的直接作用靶点，深入研究 调控血管新生机制。 3. 发现 不同靶分子蛋白上共同的可结合的位点或 共有的化学修饰方式。 课题 承担单位：复旦大学；上海理工大学 课题负责人：朱依纯 教授 课题参加人员 ：王睿 、 钱睿哲 、 付伟 、 卢宁 、 蔡文杰 、 王文伟 经费比例： 23 课题 2. 真核细胞中蛋白质表达谱、 蛋白间相互作用 以及蛋白与核酸的相互作用的调控 主要 研究内容 ： 最近发现的内源性信号分子，对细胞具有独特的调控作用。 本课题 以 酵母 为 模式生物 ，通过 基因组学和蛋白组学 的方法，阐明 响 细胞周期 、 细胞增殖和 细胞 凋亡 的信号通路， 确定 用的重要靶分子，绘制 一幅完整的 胞效应 的 信号通路图 。将酵母中的 研究结果进一步到 心肌细胞 加以验证。该工作有望全面系统的阐明 胞效应的分子机制与调控网络， 为通过 径干预重大疾病找到新的靶点 。 研究目标 ： 结合基因组学和蛋白质组学 , 生物化学和分子生物学以及细胞生物学的结果在裂殖酵母中绘制一幅完整的 胞效应得 信号传导通路图 。 分离出多个参与 细胞周期， 细胞增殖和凋亡过程中 信号通路中的重要蛋白因子，重点研究重要蛋白因子在各个信号通路中的作用机理，揭示 胞效应的分子机制 ， 为在哺乳动物中 揭示 胞效应的分子机制和阐明 生理病理上的作用提供巨大的帮助和 奠定基础。 课题 承担单位： 复旦大学；南开大学 课题负责人： 授 课题 参加人员 ： 陈东戎 、 王哲 、 王铭洁 、 霍克克 经费比例： 20 课题 3. 含硫氨基酸及其衍生物 对心脏作用靶点及 代谢途径研究 主要研究内容： 体内 含硫氨基酸及从食物中摄入的含硫化合物通过酶的作用分解代谢产生 脏中产生 关键酶是 本课题 首次发现半胱氨酸衍生物 过促进 成而 具有心血管保护作用。我们 进一步合成了具有自主知识产权的 半胱氨酸衍生物 具有更好的心血管保护作用。在此基础上，我们拟通过代谢组学的方法， 全面揭示含硫氨基酸 及其衍生物（如 体内的代谢规律 ，确定 与含硫氨基酸及探针药物 脏 保 护作用密切相关的关键蛋白质 ，并对其功能进行 深入 研究 。设计、优化、合成更好的具有药用前景的 体化合物，为 体药物的临床应用打下基础 。 研究目标： 1. 阐明 心 肌缺血 保护作用 的分子机制，鉴定出其作用的关键蛋白，揭示其调控网络。 2. 进一步优化 结构 ， 设计合成出具有更好心肌保护作用的 体化合物，为其临床应用奠定基础。 3. 阐 明含硫氨基酸和 体内的代谢途径，确定其代谢的关键酶，建立体内含硫氨基酸代谢途径研究的关键技术。 4. 阐明缺血、缺氧病理条件下 心肌保护作用的机制和经由 代谢途径，鉴定出其影响的关键蛋白质和信号通路，揭示 否具有反馈调节作用 ，从而发现干预心脏疾病病的全新靶蛋白。 课题 承担单位： 复旦大学 课题负责人： 朱依谆 教授 学术骨干： 郭薇 、林国强、 储以微 、 赵伟利 、 孙逊 、 魏邦国 、 古险峰 经费比例： 34 课题 4. 心 肌 中 局部 内源性 成调控及传递 主要 研究内容 ： 以小鼠为模式动物，综合 运用基因组学和蛋白质组学的方法，着重研究已知的心脏中内源性 生成关键 酶 心脏生理和病理条件下的表达调控，阐明其信号通路和调控网络。本课题同时研究 径在心脏内源性 生中的作用及在心脏生理和病理过程中的表达调控。本课题还将研究内源性 细胞内和细胞间的传递及传递过程中与氧化性小分子及金属离子的相互作用，探讨其在体内的代谢途径。 研究 目标 ： 1. 构建携带 动子控制的报告基因的转基因小鼠，在整体水平上实现在生理条件下和病理条件下对 达调控的实时观测和在体研究。 2. 通过生物信息学、分 子生物学、生物化学和生物物理的方法阐明生理条件和病理条件下达调控的分子机制，阐明调控的信号网络。 3. 阐明 径在心脏生病理条件下表达调控的机制，及其对心脏内源性 生的作用。 4. 阐明 细胞内和细胞间的传递过程，以及传递过程中与氧化性小分子和金属离子的反应特性。 课题 承担单位：同济大学 ；复旦大学 课题负责人：郭占云 研究员 学术骨干： 查锡良 、 郜洪文 、 杨奕清 、 孙晓宇 、 邵晓霞 、 朱融融 、 吴玲玲 博士后 经费比例： 23% （四）课题技术路线 （五）各课题关系： 本项目为确保参加单位 分工协作、优势互补，在明确合作方式的基础上，加强与课题组核心单位以外的其它在学科、资源、技术及人才方面有优势的实验室协作，并吸收优秀人才以个人所在实验室身份加入到对口的课题承担单位负责或参加本课题研究，以保证科研队伍组成的最佳化。实现技术平台共用、科研资源共享，研究目标集中、点面结合及研究内容紧密衔接等组织形式。同时，课题实行 2 3的滚动制，制订课题完成质量的定量考核标准，半年和一年分别进行一次研究进度考核。完成不好的课题将减少科研经费，完成好的课题将增加科研经费。 2年完成不好的单位和个人承担的课题将被取消 ，重新吸收新的课题组进行本课题的研究或将经费集中到其它有望获得较大突破的课题。 为保证项目的顺利完成及与其它 “973”项目的无缝衔接，项目将聘请国内外相关领域的著名专家，特别是 “973”相关领域的首席科学家，担任本项目的学术顾问并成立相应的顾问委员会，监督本项目的实施，参与本项目的管理并提出合理化建议。 本项目第一子课题的研究方案针对 心肌细胞离子通道的调控和 血管新生作用的两条重要生理、病理通路，结合内源性代谢产物对蛋白质结构和功能进行调控形成，尽管上述研究可使我们在明确的生理、病理通路中研究 蛋白质靶分子结构和功能的调节机制，但其局限性也是勿庸置疑的。 由此再间接地影响上述通路。因此，还必须同时在更广的范围内寻找 靶蛋白，以便发现 靶蛋白结合的共同规律；还要应用基因组学和蛋白质组学的方法，观察 否还能通过调控基因表达而使细胞蛋白质表达谱发生变化，并分析蛋白质与蛋白质，以及蛋白质与核酸间的相互作用。这部分研究将构成第二子课题的主要研究方案。第二子课题研究中所得到的较全面的关于 节基因表达和蛋白质表达谱的研究结果，将为第一子课题的研究提供更全面的信息。另一方面，第一子课题中关于 于特定蛋白靶分子及其相互作用的研究结果，将有助于分析第二子课题中观察到的蛋白质和基因表达谱的诸多变化，有助于分析上述变化中基因表达产物之间的相互关系，继而可据此通过基因敲除等方法确认上述因果关系。因此，通过第一和第二子课题在研究过程中的互动，综合应用结构生物学、蛋白质组学、基因组学和生理、病理学研究方法，既在由本课题组首先发现的两条重要心血管调控通路中有的放矢地研究 靶蛋白分子空间结构和动能 的调控及其生理、病理学意义，又能全面地反映 过学科交叉的互补作用，使 入的解答。 鉴于 一种具有心血管调节功能的内源性代谢产物，其体内代谢过程值得研究。由体内含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸）作为底物代谢产生的。但是，上述 2S 生成的作用及其机制仍有待阐明，尤其是其组织特异性的作用，如在心脏中对局部 成的调节作用至今不明。因此本项目第三子课题拟应用代谢组学方法研究含硫氨基酸及其衍生物的体 内代谢过程，研究其对内源性 生的调节作用及其机制。此外，还将以本课题组特有的含硫氨基酸衍生物 过研究其为何具有独特的调节 析含硫氨基酸在体内的代谢过程。 此外，由于 体内的半衰期极短；而其最重要的调节作用又发生在心血管系统，对于 心脏效应来说，局部生成的 能发挥更重要的调节作用。因此，本项目中还将设置子课题四，重点研究心肌局部 课题四同时研究心肌缺血、缺氧等病理状态下心肌局部 能发现新的生成 谢途径。 因此，子课题三是在整体水平上地应用代谢组学的方法系统地研究含硫氨基酸及其衍生物的代谢途径，除了 生成外，还观察所有相关中间产物的生成，可望对内源性 子课题四则在此基础上重点研究心肌局部的 关于内源性 谢的认识进一步得到深入。事实上，子课题三、四中调控 成的关键因子 此，子课题三、四的研究也可认为是关于蛋白质对 用的研究。而子课题一、二则属于 蛋白质结构和功能的调节作用。 通过上述四个子课题的研究，可分析 蛋白质之间的相互作用，发现相互作用的基本规律，揭示 控若干重要心血管生理、病理过程的机制。其研究成果还有望对于蛋白质组学的进一步发展作出一定的贡献。 四、年度计划 2010 年 1 月至 2010 年 12 月 1. 研究内容 1）在心肌细胞中研究 介导 型 道抑制效应中的作用；阐明 2S/ 2） 研究在血管内皮细胞中是否存在 1 生存素通路，并研究这一通路分别与血管内皮细胞的增殖、迁移以及管腔形成的关系。 3）用裂殖酵母生物芯片对比在细胞内 有 2 4）在酿酒酵母中全基因组基因敲除的文库和全基因组基因基因过表达的文库，对比在细胞内 有 2 5）阐明 其衍生物对 否具有反馈调节作用； 氧状态下原代培养心室肌细胞的比较蛋白组学研究。 6）明确 肾脏及肝脏中的代谢，完成动物实验。 7） 克隆 调控区，构建用于转基因小鼠的表达载体；通过显微注射的方法构建携带 培养心肌细胞 ， 通过 建立测定体内 化性小分子和金属离子的方法。 2. 预期目标 1）阐明 2S/ 2）阐明 1 生存素通路对血管新生的影响。 3）利用在酿酒酵母中所得结果对比，补充和证实裂殖酵母在基因组学和蛋白组学所得的实验结果，阐明在细胞内有 2 4）构建出 动子 步得到携带 动子控制的报告基因的转基因小鼠；建立小鼠心肌细胞的培养体系，确定 立起测定体内 化性小分子和金属离子的方法。 5） 阐明 心肌缺血时线粒体 子通道的影响及其抗氧化作用关键蛋白 6）揭示 放 出其代谢过程中的关键酶。7）发表 篇以上，申请专利 1 2项。 8）培养研究生（博士生，硕士生） 25名以上。 2011 年 1 月至 2011 年 12 月 1. 研究内容 1）研究 的结合位点，结合后靶分子空间构象的变化与其功能之间的关系。 2）研究 3) 利用双向电泳和质谱的方法，对比在细胞内有硫化氢和没有硫化氢的条件下全基因组蛋白表达谱的差异。 4）通过计算机模拟对 相互作用进行了初步研究。分析 性位点的化学性质，在设计中引入羟基，肼基，羧基，胍基，脲基，羟胺基等极性基团以加强与 行活性筛选。 5）通过生物信息学、 选转基因小鼠并建系；研究抑制 达后 径的变化；研究 细胞膜的相互作用。 2. 预期目标 1）阐明 的结合位点，结合后靶分子空间构象的变化与其功能之间的关系。 2）阐明 3）得到生物芯片和蛋白差异表达谱，分离出重要蛋白因子 。 4) 完成在巯基上引入一系列疏水片段，以加强 将该一系列化合物应在心肌 缺血模型上验证心肌的保护作用，完成 合物 的初筛。 5） 找到调控 立转基因小鼠纯系；在 白质和酶活力水平确定 抑制后 径的变化；建立研究 膜作用的研究方法，阐明作用的特性。 6）发表 篇以上，申请专利 1 2项。 7）培养研究生（博士生，硕士生） 25名以上。 2012年 1月至 2012年 12月 1. 研究内容 1） 1而抑制其开放。在心肌细胞 中观察同位素标记的 型 道结合（包括 1）。 2）观察 2S/ 3） 找到这些重要蛋白因子在大鼠心肌细胞中的同源蛋白。用酵母双杂交的方法大规模筛选重要蛋白在体内的相互作用蛋白。同时利用 术筛选重要蛋白在体内的 免疫共沉淀（ 和 凝胶阻滞（ 离子表面共振的结构和构象； 4） 将分离的重要蛋白因子在裂殖酵母中作转基因和敲除研究，分析其在细胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通过提高或降低硫化氢在细胞中的浓度对比野生型细胞，转基因细胞和敲除细胞的表型。 5） 采用基因突变技术改变 蛋白的分子结构，分析 靶蛋白上的作用位点，揭示 理过程的影响。 6） 通过活体成像技术，监测报告基因在生理条件下表达调控；研究 7） 利用转基因小鼠建立 I/拟病理条件下抑制 后 究外源 2. 预期目标 1）阐明 介导的 定作用而间接调控 1而抑制其开放。 2）阐明 型 道结合。 3）阐明 4） 揭示硫化氢对蛋白， 5） 观察 变 析 示 理过程的影响。 7） 实验 明 建立起小鼠 I/ 8） 在 白质和酶活力水平确定病理条件下 阐明外源 9）发表 篇以上 ， 申请专利 1 2项 。 10）培养研究生（博士生，硕士生） 20名以上。 2013 年 1 月至 2013 年 12 月 1. 研究内容 1）在心肌细胞中观察 L 型 道的 1亚单位的相 应位点是否被激活。在 型 道的 1亚单位，研究 型 道的机制。 2）通过核磁共振、质谱、红外光谱扫描、元素分析等实验方法，结合计算机辅助分子动力学模拟分析，研究 3） 将分离的重要蛋白因子在裂殖酵母 /大鼠心肌细胞中作转基因和敲除研究，分析其在细胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通过提高或降低 硫化氢在细胞中的浓度对比野生型细胞，转基因细胞和敲除细胞的表型 。 4） 用酵母双杂交的方法大规模筛选重要蛋 白在体内的相互作用蛋白。同时利用 免疫共沉淀（ 凝胶阻滞（ 等离子表面共振 ） 生物 对缺血、缺氧状态