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莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇虿蚀腿芆荿薃肅芅蒁螈羁芅薃薁袇芄芃螇螃芃莅蕿肁莂蒈螅羇莁薀薈袃莀芀螃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄莈蚇蚄羀莇莆袀袆羃葿蚃螂肂薁袈肀肂芁蚁羆肁蒃袆羂肀薅蝿袈聿蚇薂膇肈莇螈肃肇葿薀罿肆薂螆袅膆芁蕿螁膅莄螄肀膄薆薇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈膁蒀袁螄膁薃蚃肂膀节衿羈艿莅蚂袄芈蒇袇螀芇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糖源时,醋酸菌将乙醇变为乙醛,再将乙醛变为醋酸。C2H5OHO2CH3COOHH2O10、控制发酵条件的作用醋酸菌对氧气的含量特别敏感,当进行深层发酵时,即使只是短时间中断通入氧气,也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为3035,控制好发酵温度,使发酵时间缩短,又减少杂菌污染的机会。有两条途径生成醋酸直接氧化和以酒精为底物的氧化。11、实验流程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒(醋酸发酵果醋)12、酒精检验果汁发酵后是否有酒精产生,可以用重铬酸钾橙红色来检验。在酸性条件下,重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2L,再滴入物质的量浓度为3MOL/L的H2SO43滴,振荡混匀,最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴,振荡试管,观察颜色。13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的;排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的;出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接,其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时,应该关闭充气口;制醋时,应该充气口连接气泵,输入氧气。疑难解答(1)你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗为什么应该先冲洗,然后再除去枝梗,以避免除去枝梗时引起葡萄破损,增加被杂菌污染的机会。(2)你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染要先冲洗葡萄,再除去枝梗;榨汁机、发酵装置要清洗干净,并进行酒精消毒;每次排气时只需拧松瓶盖,不要完全揭开瓶盖等。(3)制葡萄酒时,为什么要将温度控制在1825制葡萄醋时,为什么要将温度控制在3035温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围反应式为C6H12O62、含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。3、常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。4、亚硝酸盐为白色粉末,易溶于水,在食品生产中用作食品添加剂。5、膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康,国家规定肉制品中不超过30MG/KG,酱腌菜中不超过20MG/KG,婴儿奶粉中不超过2MG/KG。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外,但在适宜PH、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。6、测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下,亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后,与N1萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料,与已知浓度的标准显色液目测比较,再计算泡菜中亚硝酸盐含量。7、一般在腌制10天后亚硝酸盐含量开始降低,故在10天之后食用最好。请划出亚硝酸盐含量随时间变化的曲线,并分析原因专题二微生物的培养与应用课题一微生物的实验室培养1、培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质,是进行微生物培养的物质基础。2培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。3、在液体培养基中加入凝固剂琼脂(是从红藻中提取的一种多糖,在配制培养基中用作凝固剂)后,制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。4、液体培养基应用于工业或生活生产,固体培养基应用于微生物的分离和鉴定,半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。5按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成,其中成分的种类比例明确,常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成,常用于实际工业生产。6按照培养基的用途,可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物生长,促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的,用以鉴别不同类别的微生物。7培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。8碳源能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NAHCO3等无机碳源;糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源,自养微生物能利用无机碳源。单质碳不能作为碳源。9氮源能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3、NH4(无机氮源)蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有机氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。10培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如,A培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素,B培养霉菌时须将培养基的PH调至酸性,C培养细菌是需要将PH调至中性或微碱性,细菌PH6575真菌56放线菌7585D培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵,要注意以下几个方面对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么目的答无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法,所用器械是高压蒸汽灭菌锅。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)方法步骤计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(2)倒平板操作的步骤将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上,右手拿装有培养基的锥形瓶,左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶,将瓶口迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,右手将锥形瓶中的培养基(约1020ML)倒入培养皿,左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固,大约需510MIN。然后,将平板倒过来放置,使培养皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的讨论1培养基灭菌后,需要冷却到50左右时,才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可以进行倒平板了。2为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰答通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。3平板冷凝后,为什么要将平板倒置答平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。4在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用来培养微生物吗为什么答空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌(1)微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。(2)平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。(3)稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。(4)用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落,以便于纯化菌种。(5)平板划线法操作步骤将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环,并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰,并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙,右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板将平板倒置放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗为什么答操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种。使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。2在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线答以免接种环温度太高,杀死菌种。3在作第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线答划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(6)涂布平板操作的步骤将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液,滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却810S。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求,想一想,第2步应如何进行无菌操作应从操作的各个细节保证“无菌”。例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围;等等。菌种的保存(1)对于频繁使用的菌种,可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上,在合适的温度下培养。当菌落长成后,将试管放入4的冰箱中保藏。以后每36个月,都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。缺点这种方法保存的时间不长,菌种容易被污染或产生变异。(2)对于需要长期保存的菌种,可以采用甘油管藏的方法。在3ML的甘油瓶中,装入1ML甘油后灭菌。将1ML培养的菌液转移到甘油瓶中,与甘油充分混匀后,放在20的冷冻箱中保存。疑难解答(1)生物的营养营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动,保证发育、生殖所需的外源物质。人及动物的营养物质水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。(2)确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温12天,无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥,尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后,才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为他们能合成脲酶尿素最初是从人的尿液中发现的筛选菌株人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、PH等),同时抑制或阻止其他微生(1)实验室中微生物的筛选应用的原理物生长。(2)选择性培养基在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,称作选择培养基。(3)配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如,培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物;培养基中不加入氮元素,可以选择培养能固氮的微生物;加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目(1)测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确,一般设置35个平板,选择菌落数在30300的平板进行计数,并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,因此,统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。CVM设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外,其他条件都相同的实验,其作用是对照试验组,排除任何其他可能原因的干扰,证明确实是所测试的条件引起相应的结果。实验设计实验设计包括实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。(1)土壤取样同其他生物环境相比,土壤中的微生物,数量最大,种类最多。在富含有机质的土壤表层,有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、PH7的土壤中取样。铲去表层土,在距地表约38CM的土壤层取样。(2)样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中,通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量,一般选用104105106测定放线菌的数量,一般选用103104105测定真菌的数量,一般选用102103104(3)微生物的培养与观察不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌303712天放线菌252857天霉菌252834天每隔24小时统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果,这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说,在一定的培养条件下(相同的培养基、唯独及培养时间),同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色疑难解答(1)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好能统计3个平板,计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数(C/V)M其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ML),M代表稀释倍数课题三分解纤维素的微生物的分离纤维素,一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物,是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素与纤维素酶(1)棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物,木材、作物秸秆等也富含纤维素。(2)纤维素酶是一种复合酶,一般认为它至少包括三种组分,即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖,为微生物的生长提供营养。纤维素分解菌的筛选(1)筛选方法刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。(2)刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时,刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红纤维素的复合物就无法形成,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样,我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养(此步是否需要,应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落(1)土壤采集选择富含纤维素的环境。(2)刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板(3)刚果红染色法种类一种是先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应,另一种是在倒平板时就加入刚果红。两种刚果红染色法的比较方法一是传统的方法,缺点是操作繁琐,加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂;其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便,不存在菌落混杂问题,缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质,可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊,因为培养基中纤维素占主要地位,因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是有些微生物具有降解色素的能力,它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈,与纤维素分解菌不易区分。对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后,只是分离纯化的第一步,为确定得到的是纤维素分解菌,还需要进行发酵产纤维素酶的实验,纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法,一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。疑难解答(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌由于生物与环境的相互依存关系,在富含纤维素的环境中,纤维素分解菌的含量相对提高,因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。(2)将滤纸埋在土壤中有什么作用你认为滤纸应该埋进土壤多深将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集,实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10CM左右腐殖土壤中。(4)为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物在选择培养的条件下,可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖,而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制,因此可以起到“浓缩”的作用。专题三植物的组织培养技术课题一菊花的组织培养植物组织培养的基本过程1、细胞分化在生物个体发育过程中,细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程(基因的选择性表达的结果)。2、离体的植物组织或细胞,在培养了一段时间以后,会通过细胞分裂,形成愈伤组织,愈伤组织的细胞排列疏松而无规则,是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程,称为植物细胞的脱分化,或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养,又可以重新分化成根或芽等器官,这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗,移栽到地里,可以发育成完整的植物体。3、植物细胞工程具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞,都具有发育成完整个体的能力,即每个生物细胞都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来,这是因为在特定的时间和空间条件下,通过基因的选择性表达,构成不同组织和器官。4、植物组织培养技术的应用有实现优良品种的快速繁殖;培育脱毒作物;制作人工种子;培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。5细胞分化是一种持久性的变化,它有什么生理意义使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化,有利于提高各种生理功能的效率。比较根尖分生组织和愈伤组织的异同影响植物组织培养的条件材料不同的植物组织,培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说,容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好,容易诱导脱分化和再分化。营养离体的植物组织和细胞,对营养、环境等条件的要求相对特殊,需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基,其中含有的大量元素是N、P、S、K、CA、MG,微量元素是FE、MN、B、ZN、CU、MO、I、CO,有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。激素植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下,细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素,其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。环境条件PH、温度、光等环境条件。不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养,一般将PH控制在58左右,温度控制在1822,并且每日用日光灯照射12H6操作流程A配制MS固体培养基配制各种母液将各种成分按配方比例配制成的浓缩液(培养基母液)。使用时根据母液的浓缩倍数,计算用量,并加蒸馏水稀释。配制培养基应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液,并用蒸馏水定容到1000毫升。在菊花组织培养中,可以
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