GBT 26612-2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程

5 020 30B 43  266122011纯血马NA 60111101实施宰瞀粥紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19刖菁本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业大学马研究中心、中国马业协会。本标准主要起草人：赵春江、吴常信、韩国才、张浩、吴克亮、杜丹、韩文朋2661220范围纯血马程、结果的记录和解读等本标准适用于纯血马的亲子鉴定。2规范性引用文件2661220下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其撮新版本适用于本标准。383法庭科学NN1 纯血马定、在2 镦卫星微卫星原理根据微卫星微卫星中包括国际动物遗传协 会(过凝胶电泳判定个体的基因型。根据盂德尔遗传规律，比对亲代个体和子代个体各微卫星而达到亲子鉴定的目的。5试剂与器材51试剂51 1乙醇(分析纯。512异丙醇(分析纯。513氢氧化铺(分析纯。514乙二胺四乙酸二钠(分析纯515氯化钠(分析纯。516十二烷基硫酸钠(分析纯。517乙酸钾(分析纯。518氧化锂(分析纯。2661220519氯化钾(分析纯。 5110氧化镁(，分析纯。5111 30(质量分数)丙烯酰胺溶液：将29丙烯酰胺和1N，N一亚甲双丙烯酰胺溶于去离子水，充分搅拌溶解井过滤去杂质，避光保存。5112过硫酸铵，分析纯。5113硼酸(分析纯。5114乙酸，分析纯。5115甘油，分析纯。51 16四硼酸钠，分析纯。5117硝酸银(分析纯。5118甲醛，分析纯。5119溴化乙锭，分析纯。5120 121溴酚蓝，分析纯。5122盐酸(分析纯。5123三(羟基甲基)氨基甲烷(分析纯。5124 1 25三磷酸脱氧核苷酸混合物(等量的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(三磷酸胸腺嘧啶脱氧棱苷酸(三磷酸胞嘧啶脱氧棱苷酸(混合物。526毛囊裂解液：200 1 27中和液：20000CI，1 28缓冲液：a)血液裂解缓冲液()：100 100005(质量分数)b)蛋白沉淀缓冲液(20000c)E)：100泳解缓冲液54645 0 )；e)电泳解缓冲液50冰乙酸，01一o)；I)上样缓冲液；306(体积分数)丙三醇，005蟛(质量体积分数)溴酚蓝，0；g)1000CI(0551 29琼脂糖(分析纯)。5130 N，N，N，N四甲基乙二胺(51 31琼酯糖胶：琼脂糖加入电泳解缓冲液，加热熔解冷却后制成的胶状物，可用于2器材521全自动22离心机，离心力23紫外可见分光光度计。524移液器，量程0100025 6孔热循环。526水平电泳槽，长度31266122052 7垂直电泳槽，长度242 8凝胶成像系统。529漩涡振荡仪。5210剪刀，6中提取体方法参见附录A。1119。62亲子鉴定所用所扩增的位点中还可包括进一步提高亲子鉴定的准确性。引物序列参见附录B。63 用383。64基因型的检测使用根据荧光信号探测见附录D)等可检测两个碱基长度差异的方法检测上述12个位点的基因型。在分析中设置对照样本。上述操作技术要求见1193。6 5基因型的表示方法基因型用国际通用的字母表示。在所检测的微卫星位点中，等位基因数为奇数的，片段长度居中的基因型记为“M”；如等位基因数为偶数，居中的两个基因型中片段较小的定义为“M”。其他等位基因对照“M”按升序排列。微卫星位点基因型的记录参见附录E。66亲子关系的判断根据两亲本及子代个体的基因型判断其是否存在亲子关系。基因型的读取和亲子关系的判断由两人分别独立完戚，其结果互相印证。67否定个案的重复检测对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，重新采取次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系。7亲子鉴定结果的记录71亲、子代基因型相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型相符的个案，记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型，并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测，不能排除子代个体与两亲本存在亲子关系”，并由亲子鉴定负责人签字。72亲、子代基因型不相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型，并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测，可排除子代个体与两亲本存在亲子关系”，并由亲子鉴定负责人签字。2661220附录A(瓷料性附录) 从血液或毛囊中提取1从马颈静脉采取血样5移液器量取质量分数)12取5013加入400“分混合至凝块消失。A14 65温浴2h4h。A1 5加入800“倒混合，然后冰浴10放人一20冰箱内50A1 6用离心机在室温下以12000r1 7吸取 意不要吸刊下层沉淀物或表层漂浮物，必要时可重复离心去除沉淀物。A颠倒混合几次。 A19室温12000rI 10弃上清液，然后用70吖(体积分数)乙醇(洗两次，室温干燥，加入150 111在水平电泳槽内用质量分数)琼脂糖胶电泳检测用紫外可见分光光度计，以260280吸光度检测11220保存。1采取马的鬃毛，应该带有毛囊，10支以上。A22取02记样品号。A23取6根10根带有毛囊的毛样，在根部用剪刀剪切约05免粘在剪刀上)，放人离心管中。加入80吐毛囊裂解液(此浓度为黑毛样品的用量，栗毛加g毛囊处，漩涡振荡仪上迅速漩涡混合32 5在502017102 6从热循环仪上取下样品，加入80浓度为黑毛样品的用量，栗毛加23浓度的中和液)，漩涡混合32 720保存。附录B(资料性附录)用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物如表B1所示。表2661220位点名称序列(537)正向：2661220跗录c(资料性附录)扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小位点名称标记颜色片殷大小浓度蓝色黄色绿色绿色绿色黄色蓝色蓝色黄色00)l物(50t”)各2U5板000增每个位点所需的最佳镁离子浓度参见表应条件：4预变性4变性30s，退火30s(扩增每个位点所需的最佳退火温度参见表C1)，72延伸45s，30个循环。72延伸30保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知可成功扩增的马等体积的重蒸馏水代替模板25入100电泳缓冲液50热充分熔解后制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过凝胶。将4止V酚蓝迁移至凝胶中部停止。将胶放人溴化乙锭溶液(浓度为染色15用凝胶戒像系统观察电泳结果并记录。附录D(资料性附录)采用银染进行做卫星2661220D112(质量分数)聚丙烯胺凝肢(251作及电泳D11清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，晾干后上垫条，用夹子夹好。质量分数)聚丙烯酰胺105体积分数)的甘油，电泳解缓冲液50“(质量分数)过硫酸铵0175入蒸馏水7325合均匀后迅速灌胶。上述为一块胶的量，多块胶时按比例加倍。入梳子，室温放置至其聚合。D14凝胶聚合好后，向垂直电泳槽加入1注射器冲洗加样孔。D15预电泳10后上样、电泳。D2硝酸银染色方法用去离子水冲洗胶。用2