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文档简介

FCGR2A基因单核苷酸多态性与川崎病研究分类号学校代码密级学号学位类别科学学位团专业学位口学科门类医学又砰鲁斜袁警硕士学位论文蟠枷论文题目基因单核苷酸多态性与川崎病的研究一级学科临床医学二级学科儿科学论文作者纪玉晓指导教师张宏艳教授天津医科大学研究生院二一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外,论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名丝茧竺日期如噼月昭学位论文作者签名垒些盟兰日期如眸月昭学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定,即学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文,并编入有关数据库。保密口,在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密圈。请在相对应的方框内打“”学位论文作者签名垒垂蛤期加婶月幻日导师签名日期山哆年月力日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的川崎病的全基因组关联性研究显示彤删基因单核苷酸多态性凼,与川崎病,伪易感性相关,且这种相关性己在其它种族人群中进行了研究,但该相关性在国内研究尚无。因此,本研究致力于探讨基因多态性与川崎病易感性的关系。方法采用病例一对照研究,选取年月至年月在天津市儿童医院住院治疗的患儿例为病例组,同期于该院门诊行外科手术治疗的术前儿,童例为对照组,其中根据有无并发冠状动脉损害,患儿可分成两组冠状动脉损害组和无冠脉损害组。采集外周静脉血,提取基因组,应用聚合酶链反应联合直接基因测序技术对研究对象的基因多态性进行检测。比较组与对照组以及组和组中基因基因型和等位基因频率。结果在所有研究对象中均检测到基因位点,该位点存在种基因型,。病例组与对照组基因基因型货尸和等位基因配尸分布频率比较差异显著氏,其中等位基因使中国汉族儿童使发生的危险性增大。组与组基因位点基因型,和等位基因,的频率分布比较差异显著尸天津医科大学硕士学位论文携带等位基因使患儿发生的危险性增高组中等位基因的频率高于等位基因的频率。结论基因多态性可能与儿童易感性及并发相关。基因位点等位基因可能为儿童患的危险因素。基因位点等位基因可能增加患几并发的危险性。关键词基因川崎病冠状动脉损伤单核苷酸多态性天津医科大学硕士学位论文,如。噼峨,妒一矿,矿尸矿,天津医科大学硕士学位论文蝴曲天津医科大学硕士学位论文目录中文摘要缩略语/符号说明前言研究现状、成果研究目的、方法基因单核苷酸多态性与川崎病的研究对象和方法研究对象实验原理主要仪器设备及实验试剂血液标本的采集和处理血液基因组提取基因组的鉴定引物准备扩增琼脂糖凝胶电泳判断产物一质量控制产物测序及测序图的分析统计学分析结果质量的鉴定扩增产物的鉴定测序结果统计学结果讨论结论研究不足及展望。参考文献发表论文和参加科研情况说明附录一综述一天津医科大学硕士学位论文川崎病易感基因的研究进展一综述参考文献一致谢天津医科大学硕士学位论文缩略语/符号说明英文缩写英文全称中文全称碱腺嘌呤弘冠状动脉瘤冠状动脉扩张冠状动脉损害胞嘧啶数据库脱氧核糖核酸由鸟嘌呤殍豫】、,静脉注射丙种球蛋白幽川崎病皮肤黏膜淋巴结综合征美国国家生物技术情报中心优势比聚合酶链反应单核菅酸多态性咄胸腺嘌呤超声心动图置信区间拷贝数变异天津医科大学硕士学位论文全基因组关联分析天津医科大学硕士学位论文一月吾研究现状、成果川崎病,是一种病因未明的急性发热出疹性的小儿疾病,年由日本川崎富作医生首次描述,并命名为皮肤黏膜淋巴结综合征,。本病在婴儿及儿童均可发病,但患者在岁以内,好发于个月婴儿,男孩较多,男女比例为。主要病理改变为全身非特异性血管炎,累及中小血管特别是冠状动脉,最严重的并发症是冠状动脉损害包括心肌梗死,冠状动脉扩张,冠状动脉瘘或冠吠动脉瘤,捌。目前在美国和日本,已取代风湿热成为儿科常见的后天性心脏病的主要原因,且成为成年后缺血性心脏病的危险因素之一【。吉林省年崎病流行病学调查显示确诊的病例数逐年呈增高趋势发病年龄越小,心脏后遗症的发病率越高,后遗症以冠状动脉扩张为主【。多年来,已经引起越来越多的关注,目前该病已在世界绝大多数国家或地区有报道。有关其流行病学调查、发病机制、诊断标准和治疗方法的临床研究取得了重大的突破和进展。川崎病的病因和发病机制尚不清楚,可能由病原体,宿主免疫失调及遗传易感性引起。川崎病所具有的明显的季节性,区域性流行,疾病自限性以及发病年龄高度提示该病是由病原体感染引发的【。许多病毒,细菌以及支原体,衣原体被认为和川崎病的发病相关,但没有一个得到证实【。大量证据显示在某些特定人群的发病率升高,如以岁以下儿童为统计对象,在不同国家和地区的发病率从高到低排列依次为日本、韩国、中国台湾地区和中国香港地区【】。在我国北京、重庆、山东、陕西等地均有发病,其中陕西省是高发地区。在日本发病率一直在持续上升并且近些年来年龄岁的儿童的年发病率/,发病率比西方国家高倍。夏威夷日裔儿童的川崎病发病率与日本国内的发病率相同【】。具有家族聚集倾向,患儿同胞的发生率是普通儿童的倍,双亲中有史的儿童比普通儿童有更高的患病率,且复发的机率也增大【】。这些证据均提示提示遗传因素对的发生有重要影响,因此个体是否存在易感基因已成为研究蝴因的一个新方向。天津医科大学硕士学位论文随着分子遗传学的发展,近年来对遗传因素在川崎病发病机制中的作用的认识逐步加深。目前主要通过两种方法确认疾病的易感基因。一种是候选基因法,一种是全基因组法【】。候选基因法基于基因本身己知的功能或在疾病病理生理过程的作为筛选基因,然后进行相关分析。全基因组法是指对全基因组内的常见遗传变异单核苷酸多态性,和拷贝数变异,】利用基因总体关联分析的方法,在全基因组范围内进行整体的研究,能够一次性对疾病进行轮廓性概括。全基因组层面上寻找与复杂疾病相关的易感基因是近年来人类寻找复杂疾病病因的最有效的方法之一。作为目前基因定位克隆策略的重要遗传标记,愈来愈显示出其在“稳定性,广泛性,代表性”等方面的崭新优势,被广泛应用于连锁分析与基因定位,疾病的关联分析,疾病发生的分子机理等前沿领域。基因为最近的全基因组关联分析研究,新发现的与易感性相关的位点,并且该位点的等位基因被认为是致病的危险因素,但在台湾人群中却有不一致的报道【。另外候选基因的方法对基因与易感相关性的研究也不尽相同【】。研究结果的差异可能与种族差异和遗传异质性有关。目前中国汉族人群中关于基因与及并发的相关性的研究尚无。本研究通过联合直接测序法检测天津市儿童医院汉族患儿和对照组儿童基因多态性,旨在为分子遗传学的发病机制及预测发生的提供新的研究数据。研究目的、方法本研究将探讨中国汉族童基因位点多态性与易感性及并发的关系,进而从分子生物学角度探求以及并发的发病机制,为预防及并发的发生、早期诊断及预防提供可靠科学依据。具体的研究方法如下利用网站数据库查找与易感性相关的基因编码区所有,同时运用数据库搜集相关文献。参考相关文献,最终确定所要研究的位点。天津医科大学硕士学位论文进行临床标本和临床数据资料收集和整理。采用病例对照研究方法,川崎病组例患儿及对照组儿童例在取得父母或监护人知情同意后取外周静脉血抗凝,置于冰箱保存。基因测序评基因位点与川崎病并冠状动脉损害的研究。血液提取一引物准备一扩增目的片段一产物的鉴定一沪物测序一数据分析。运用。软件进行相关数据分析遗传平衡检测样本是否符合孟德尔遗传规律川崎病例组与对照组间、组与组间基因位点等位基因频率及基因型频率的比较,各个等位基因、基因型与及并发的关系。天津医科大学硕士学位论文对象和方法基因单核苷酸多态性与川崎病的研究川崎病妣,是一种主要发生在岁以下儿童的急性自限性血管炎综合征。它可引起全身多系统受累,尤以冠状动脉为甚。目前在发达国家和地区,已取代风湿热成为儿科常见的后天性心脏病的主要原因,且成为成年后缺血性心脏病的危险因素之一。目前川崎病的病因和发病机制尚不清楚,可能由病原体,宿主免疫失调及遗传易感性引起。随着分子遗传学的发展,遗传因素在川崎病发病机制中的作用成为研究病因的一个方向。基因讧为最近的全基因组关联分析研究,新发现的与易感性相关的位点,并且该位点的等位基因被认为是致病的危险因素【】,但在台湾人群中却有不一致的报道】。另外候选基因的方法对基因与易感相关性的研究也不尽相同】。研究结果的差异可能与种族差异和遗传异质性有关。目前中国人群中关于基因与及并发的相关性的研究尚无。本研究通过联合直接测序法检测天津市儿童医院患儿和对照组儿童基因多态性,旨在为分子遗传学的发病机制及预测发生的提供新的研究数据。对象和方法研究对象本项研究的研究对象共包括病例组例,对照组例。病例组选择例年月至年月在天津市儿童医院住院治疗的患儿,其中男孩例,女孩例,男女之比为,年龄个月至岁,平均年龄土岁。所有患儿均符合美国心脏病协会制定的诊断标准【发热持续天以上,抗生素治疗无效,不能被其他已知疾病所解释双眼结膜充血无渗出物唇鲜红、皲裂,口唇黏膜弥散性充血,杨梅舌多形性红斑、皮疹急性期有手足硬肿,掌跖红斑在恢复期指趾端甲床皮肤移行处有膜状脱皮急性非化脓性颈淋巴结大,常为单侧,其直径或更大。其中发热天为必备条件,满足其余标准中的项。除外其他疾病可确诊为具备项者,若经二维超声心动图或冠状动脉造影确诊存天津医科大学硕士学位论文对象和方法在冠状动脉扩张或冠状动脉瘤,除外其他疾病,亦可确诊。明确诊断后发病天内均给予静脉注射丙种球蛋白,单次剂量/静脉滴注及口服阿司匹林治疗。患儿均于治疗前和出院前行超声心动图检查冠状动脉情况。入组所有儿童均行超声心动图检查患儿取平卧位或左侧卧位,哭闹不合作患儿给予二维彩色多水合氯醛镇静,/所有患儿均在安静状态下检查。普勒超声心动图仪,探头,根据文献【】操作方法,仔细、小心地旋转探头获得满意图像,分别测量右冠状动脉主干、左冠状动脉主干、左前降支和左回旋支的内径。以上操作均由操作熟练的心血管专业超声医师进行,每个测量位置测次,取次的平均值做为最终测量数值。日本卫生部于年制定的川崎病并冠状动脉异常的诊断标准【】岁任一段冠状动脉患儿冠状动脉内径岁患儿冠状动脉内径内径是邻近段的倍或管腔不规则明显异常者。当冠状动脉呈瘤样扩张时即可判断为冠状动脉瘤。美国心脏病学会【】制定的冠状动脉瘤的分类内径、为小型冠状动脉瘤,内径,、为中型冠状动脉瘤,为巨大型冠状动脉瘤。根据使用治疗后有无并发冠状动脉损伤将例川崎病患儿分为冠状动脉损害组地例和无冠状动脉损害组例。对照组选择同时期于该院门诊准备行外科手术的例儿童作为对照组,均排除感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等,并排除既往病史。其中男例,女例,男女之比,年龄个月至岁,平均年龄土岁。病例组和对照组年龄、性别无显著差异。全部研究对象均为汉族儿童,相互之间无血缘关系,籍贯为天津及河北省所辖区县。本研究获所有入选儿童家长或监护人知情同意及天津市儿童医院伦理委员会的批准。实验原理的基本原理技术是一种选择性体多聚酶链式反应即外扩增或片段的方法,以一段双链为模板,一对引物为引导,在四中脱氧三磷酸腺苷存在下的聚合酶酶促反应。其特异性是由人工合成天津医科大学硕士学位论文对象和方法的引物序列决定的。应用这一技术可以将微量目的基因片段扩增一百万倍以上。该技术在其发明之初,需进行手工操作,由于没有耐热的聚合酶,所以每一个循环经过。左右变性后,聚合酶都会失活,需要加入新的酶,操作非常繁琐。后来随着耐热的聚合酶的发现和应用,的自动化才成为可能。另外随着仪自动化程度的不断提高,的操作也己经变得非常简单,成为常规操作技术之一,的种类非常繁多,己经发展出了反转录、原位、抗原扑获套式和混合、不对称等。相关技术的发展和应用像扩增技术本身一样迅速成倍增长,渗透于生物学科的各个分支。反应理论的提出和技术的完善对于分子生物学的发展具有特殊的意义,它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法之一,并使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的因此贡献而获得了年度诺贝尔化学奖。的基本工作原理是以拟扩增的分子为模板,以一对分别与模板末端和末端互补的寡核苷酸片段为引物,在耐热聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的分子合成。重复这一过程,即可使目的片段得以大量扩增。基本工作原理见图所示。,铂/三一宁图基本工作原理引自网络天津医科大学硕士学位论文对象和方法组成反应体系的基本成分包括模板、特异性弓物、耐热聚合酶聚合酶、以及。含的缓冲液。的基本反应包括三个基本步骤变性将反应体系加热至,使模板完全变性成为单链,同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以打开退火将温度下降至适宜温度使引物与模板退火结合延伸模板一引物结合物在聚合酶的作用下,以为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三个过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需分钟,小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。直接测序法的基本原理澳序仪采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的标记终止物法,因此通过单引物序反应,生成的铲物则是相差个碱基的。末端为种不同荧光染料的单链混合物,使得四种荧光染料的测序铲物可在一根毛细管内电泳,从而避免了不同泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为序列,从而达到测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。直接测序是最容易实施的检测方法。通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达。采用直接测序法,还可以得到的类型及其准确位置等分型所需要的重要参数。随着澳序自动化和测序成本的降低,直接测序法将越来越多地用于的检测与分型。主要仪器设备及实验试剂主要仪器设备天津医科大学硕士学位论文对象和方法型低温高速离心机美国贝克曼公司连云港千樱医疗设备有限公司一蒸汽高压灭菌仪电子分析天平公司扩增仪型凝胶成像分析系统天龙上海科技有限公司紫外图像投射仪上海长明光学仪器厂核酸/蛋白分析仪微波炉海尔公司冰箱海尔公司冰箱日本型电泳仪北京六一仪器厂型电泳槽北京六一仪器厂一多用振荡器北京六一仪器厂恒温水浴箱上海沪西仪器厂蒸汽高压灭菌仪连云港千樱医疗设备有限公司各种型号微量加样器德国公司加样枪头北京泰克生物有限公司型基因上海生工生物工程有限公司分析仪测序仪主要实验试剂琼脂糖上海公司生产。及康为世纪生物科技有限公司天津医科大学硕士学位论文对象和方法天根生化科技北京有限公司提取试剂盒,公司溴化已定四公司,。电泳缓冲液的配制碱硼酸/加水到,调值至配制将二水胺四乙酸二钠,加水蒸馏水中剧烈搅拌,用调节至,定容至。/,/等渗溶血素使用分析天平分别称量氯化铵、碳酸氢钾,加蒸馏水定容至。后经、/高压灭菌,备用。储存液碱硼酸加双蒸水至。应用时加双蒸水稀释成应用液。琼脂糖凝胶琼脂糖蒸馏水微波炉加热至完全熔化,加溴化己定混匀,铺胶备用。分子量参照物显示带、上样量绦带组成/】其它稳定剂和增强剂血液标本的采集和处理天津医科大学硕士学位论文对象和方法所有组患儿急性期入院小时内,静脉丙种球蛋白及阿司匹林治疗前,所有对照组儿童门诊外科手术当天术前,在其家长或监护人知情同意下,使用一次性采血管含抗凝剂空腹抽取静脉血,血液标本随即移入冰箱并置于保存,半年内提取基因组。血液基因组提取的制备是后续实验的基础。将冻存于的加有枸橼酸钠抗凝剂的血液标本取出,常温下解冻,从外周血液中提取的操作方法及步骤均按照提取试剂盒的撑生产公司公司提供的说明书进行,保证了提取的质量。具体操作程序如下将静脉血放入离心管中,加入等渗溶血剂漂洗,振荡离心次,至上清液清亮为止。在标记的离心管中加入无水核酸酶,混合振荡秒钟。静置分钟,室温下离心,分钟吸取并弃掉上清液,注意勿误吸沉淀于样品中加入的液体,剧烈振荡样品管,使沉淀完全悬浮。在水浴下,加热样品分钟。剧烈振荡一秒钟。在水浴下,加热样品分钟。剧烈振荡秒钟。室温下离心,分钟。分离出的双链存在于上清液中,于保存或者直接用于。基因组的鉴定采用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法对所得的进行定性和定量实验分析,鉴定结束后,将可用的分装、标记,部分置于冰箱储存备用,其余长期保存的置于一冰箱。引物准备引物设计增产物的大小是由特异引物限定的。皈应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物。引物设计存在以下几个原则引物的长度天津医科大学硕士学位论文对象和方法引物的长度一般为。决定引物退火温度最重要的因素是引物长度。屹的含量一般引物序列中屹的含量通常为。碱基的随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其端不应超过个连续的或,因这样引物会在屺富集序列区错误引发。引物自身引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构或引物本身复性。引物之间两引物之间不应有互补性,尤其避免端互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下,一对引物见不应多于个连续碱基的同源性或互补性。本实验根据美国国立生物技术信息中心,公布的基因序列,参考相关文献,采用了文献口】设计的针对的关于基因位点引物,序列见表。表,基因位点的引物序列物的浓度由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物,为干粉,使用前先离心,然后打开管盖加入适量缓冲液溶解,通常配成贮存液浓度/,一,浓度保存。使用前取引物储存液,再次加入缓冲液稀释成。引物稀释计算公式如下分子量影解链温度单位相当于微克约。所含的摩尔数/上、下游引物各单位,相关数据见表。天津医科大学硕士学位论文对象和方法表引物相关数据引物。摩尔数上游下游扩增一循环温度及参数设置典型的循环由三部分组成模板热变性、退火、寡核昔酸延伸。变性温度与时间的变性一步非常重要,此步若不能将靶基因模板和或产物完全变性,就会导致的失败。典型的变性条件是摄氏度,或。变性温度由含量决定时间由分子长度决定。退火温度与时间退火温度和时间决定着反应的特异性。它们取决于引物的长度、浓度和屺含量。合适的退火温度应低于扩增产物在条件下真实值的。延伸温度与时间延伸温度通常为较退火温度高。左右。循环数决定着扩增程度,在其它参数优化的情况下,最合适的循环数取决于靶序列的初始浓度,一般以次为宜。过多的循环数会增非特异性扩增产物的数量和复杂性。二实验步骤反应体系的完成在的离心管中加入以下成分,总反应体积为“,包括基因组,。山,上下游引物各按照址游引物,下游引物模板啼的顺序加样,加样完毕反复吹吸使之混匀,瞬时离心,使反应成分集于管底,然后立即将离心管移入德国公司生产的扩增仪。扩增反应条件。预变性、。退火、。延伸。变性共个循环,然后。变性、。退火、。延伸共个循环,最后。终末延伸。对象和方法天津医科大学硕士学位论文琼脂糖凝胶电泳判断产物备琼脂糖凝胶准备电泳槽选择合适的水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平,检查稳压电源与正负极的连接线路。蛩入三配胶用天平称取菲脂糖粉,倒入三角烧瓶中,用量筒量角烧瓶中,微波炉加热至粉末融开。倒胶待凝胶冷却至左右时,在凝胶中加入至终浓度/,摇匀后缓缓倒入制胶模中,迅速放好梳子。凝胶的厚度在越间,避免产生气泡,尤其梳子周围不能有气泡,若有气泡,可用吸管小心吸去。凝胶条件凝胶通常需要在室温中放置分钟。拔梳子小心移去梳子和琼脂糖凝胶隔离板,保持点样孔完整。加电泳缓冲液凝胶完全凝固后,将凝胶放人电泳槽中,加入电泳缓冲液,液面应高出凝胶表面。加样皈应结束后,移出艚,瞬时离二,使因加热蒸发而附于铲物含溴酚蓝,用枪头吸入,盖顶的铲物全部汇集于管底部。取对准加样孔,在孔的上方加样,样品会沉入孔中。电泳接通电源线,开启电源开关,调到恒压,观察正负两极是否有气泡出现,如负极气泡比正极多,则表示电泳槽已经接通电源开始工作。调整电压至,。指示带位于凝胶中间位置为宜。照相和图象分析将凝胶移入紫外图像成像仪中观察,是否有荧光条带出现,进而可以移入凝胶成像仪中进行照相和图象分析。根据产物条带与带的相对位置,判断扩增产物的大小,以确定产物的特异性,并根据产物的亮度,估计产物的含量。扩增产物是否为目的基因,将产物送上海生工生物工程有限公司进行序列测定,进一步判定。质量控制天津医科大学硕士学位论文对象和方法标本采集后及时处理,放入保存枪头,离心管等试验消耗品均为一次性戴口罩、手套,防止试剂、标本受污染操作过程严格按要求步骤进行。产物测序及测序图的分析一萨物直接测序取符合实验要求的扩增产物样本各送生工生物工程上海有限公司,进行纯化、测序。二测序图的分析将测序结果在美国国立生物技术信息中心网站删用,比对生物序列一级结构的算法进行序列比较与分析。具体比较方法为,首先进入美国国立生物技术信息中心网站,其也为/,在网页最下端第二行有链接,点击进入后,在输入栏,分别输入基因的序列和沪物和测序的序列,最后点击,就会出现两个序列的对比结果。应用软件分析直接测序结果,结合测序图判断测序结果是否可靠正常情况下,除了开始约至个碱基,在以内可以达到。以上的准确率,但仪器及软件有时也会发生错读或漏读碱基的情况,此时需要判断具体是什么碱基。所以,一般需要进行正反链同时测序,在两个序列完全吻合的情况下,才能确保所得序列结果可靠性。通常情况下,一份测序结果图由红胸腺嘧啶,、黑鸟嘌呤,、绿腺嘌呤,和蓝胞嘧啶,测序峰组成,代表不同的碱基序列,纯合型位点的测序峰为单一峰型,而杂合型位点的测序峰为套峰,因而很容易将其区分开来。对于测序结果不十分明确,怀疑为位点的样本,以另一侧引物再进行测序。统计学分析运用软件进行统计学分析。计量资料采用均数标准差土表示,基因型和等位基因频率采用直接计数法统计。应用拟合优度矿检验判断病例组和对照组基因型频率是否符合平衡。采用,检验比较各天津医科大学硕士学位论文对象和方法组之间基因型及等位基因的频率,并并计算优势比,及其可信区间舭妇。为存在显著差异。结果天津医科大学硕士学位论文结果质量的鉴定血液标本提取所得的基因组经核酸定量仪测定,样品浓度在/之间,/匕值为之间,满足后续试验要求。扩增产物的鉴定按上述反应体系及条件扩增,基因扩增产物片段长度为为核酸分子量参照标准,扩增产物的目标。以条带在之间,符合实验要求。每次扩增均设立阴性对照以代替板以检测结果的可靠性。电泳结果见图。】图基因扩增产物电泳图,标本阴。性对照。测序结果病例组一对照组基因测序结果参照网站基因序列,利用该网站在线对所获序列进行对比分析发现,所有研究对象均检测到基因位点。该位点存在、种基因型。病例组中基因结果天津医科大学硕士学位论文型例,基因型例,基因型例对照组中基因型例,基因型例,基因型例。各基因型测序序列如图、所示。儿。,一,。图基因测序图箭头所示该位点基因型为瞧一扒八四舭八图基因测序图箭头所示该位点基因型为、/趣蛳觥。/、八一图基因测序图箭头所示该位点基因型测序结果的比对将病例组与对照批基孤位点序列与基因库数据见图比较、删/。比对结果显示产物测序天津医科大学硕士学位论文结果的基因序列和网站公布的基因位点的基因序列相符。比对结果见图。删湖肛陋盼嗽删印骱嘲稍渊酝/和等位基因矛携带等位基因使患儿发生的危险性增高组等位基因的频率高于等位基因的频率。见表。表组与组基因型和等位基因频率的分布,石瓦毒畅,笤基因型等位基因天津医科大学硕士学位论文讨论讨论吖受体是一类与的段结合的跨膜糖蛋白,属于免疫蛋白超家族成员。它们一端连接免疫细胞,另一端连接特异性抗体,能够引发一系列细胞效应因子的功能,诸如吞噬作用、抗体依赖的细胞毒作用、超氧离子的产生、抗原递呈、细胞因子释放以及调节抗体产生等】。根据与各亚型的亲和力的不同,可分为,/三类,其中是高亲和力受体,是低亲和力受体。根据功能的不同,丫又可分为兴奋性受体和抑制性受体。它们通过其胞质区的免疫受体酪氨酸活化基序或免疫受体酪氨酸抑制基序转导兴奋信号或抑制信号,调节免疫应答。两类受体在功能上相辅相承,而且通常共同表达于某一细胞表面,二者之间平衡状态改变,将导致免疫性疾病的发生。是表达最广泛的亚类,按功能又可分为,个亚类。与作为受体家族成员,是表达最广泛的家族成员,表达于多种免疫细胞上,包括自然杀伤细胞,巨噬细胞以及中性粒细胞,可参与细胞活化及免疫复合物的摄取。基因编码的基因,定位于人类号染色体上,该染色体因存在拷贝数变异而变得复杂。基因的功能多态性表现为编码氨基酸位置上碱基替换碱基会导致组氨酸和精氨酸氨基酸的改变。该多态性位点被命名为,刚好坐落于号染色体的拷贝数变异区外。碱基与碱基的替换极大地影响了与结合力。丫是人类唯一有效结合的受体,是保障机体内有效清除免疫复合物的免疫球蛋白受体亚型。唧位点为组氨酸残基能有效地与结合,而位点为精氨酸残基则不能与结合。因而在调理的吞噬作用中,基因型为个体的的吞噬细胞的作用较基因型为的个体更有效。因此,基因基因型的改变会导致免疫复合物清除不足,这些复合物在血管壁中沉积,引起血管病变【。已多篇文献报道其多态性与某些炎症疾病和自身免疫性疾病相关,如系统性红斑狼疮,克罗恩病,格林巴利综合症,特发性血小板减少性紫癜,类风湿关节炎等【们。本研究结果显示例患儿中基因型例,基因型例,基因型例,而健康对照组基因型例,基因型例,基天津医科大学硕士学位论文讨论因型例。两组间基因型分布频率和等位基因频率分布进行统计学分析发现两组间基因型分布频率,和等位基因频率砰存在显著差异。与文献报道一致【,等位基因是导致患儿发生的危险因素,同时基因型使发生的危险性增加。目前关于等位基因导致发生的机制尚不清楚,根据的功能学研究,推测其可能的机制是/与含有的免疫复合物交联后,在家族蛋白酪氨酸激酶的作用下,发生磷酸化,经过一系列活化信号的传递,引起磷脂酰肌醇,三磷酸盐,的产生,最终导致三磷酸肌醇和二酰甘油产生。使细胞膜上的离子通道开放,钙内流增加,免疫细胞活化,引起炎性介质如和等的释放,损伤血管内皮细胞,引起血管炎。携带等位基因的个体由于能够与结合,因此可能较携带等位基因的个体产生更强的炎症和免疫反应。联合阿司匹林口服已作为治疗川崎病的标准方案在临床上广泛使用。发生率未经治疗的川崎病患几高达,经治疗后的川崎病患儿约为,机制可能主要依赖的片段与各种免疫细胞上的的受体/相互作用而发挥抗炎的作用【。是一、/家族中重要的一员,研究发现经治疗后,患儿的基因表达下调【。因此基因多态性可能会影响治疗的疗效。年日本】等首先开展了对丫,/编码基因多态性与易感性以及治疗疗效之间的关系进行了研究,研究发现接受治疗的例川崎病患儿中,基因型/的合并发生率显著低于基因型/和非的患儿。等位基因在组的频率明显低于无组。等位基因频率在组的频率高于无组。参照美国心脏病协会及日本卫生部川崎病并冠状动脉损害诊断标准【也,本研究选取例并发患儿作为研究对象,基因型分布如下基因型例,基因型例,基因型例。组基因型例,基因型例,基因型例。经统计学分析,等位基因使中国汉族儿童发生的危险性增加。同时与等【】的研究一致,本研究结果显示组中基因型的频率明显基因型和天津医科大学硕士学位论文讨论。因此,携带等位基因的患儿应用治疗的疗效可能会优于携带等位基因的患儿。等认为中性粒细胞可能是导致患儿发生的效应细胞,通过诱导急性期的中性粒细胞凋亡来降低的发生率。因此推测发生该种结果的可能的机制是中含有的主要与携带等位基因的个体的结合,诱导自细胞凋亡或抑制白细胞中细胞因子的产生减弱炎症反应,进而抑制的发生。文献报道基因多态性可能也会影响依赖的治疗药物治疗其他疾病的疗效。例如,携带等位基因的风湿性关节炎患者应用拮抗剂英夫利昔单抗治疗预后较好【】。在小鼠模型中证实是诱导冠状动脉炎症和冠状动脉瘤形成的必要条件,从而为仅阻断剂临床治疗提供了实

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